呼吸道张力收缩、浆液分泌的调控机制及柚皮苷在此过程中的调节作用*

师瑞，王永刚，李沛波，彭维，苏薇薇

中山大学生命科学学院，广东 广州 510275

柚皮苷是本团队研究开发的一类新药，具有显著的止咳、化痰、消炎作用，已实施科技成果转化。我们的研究还证实：柚皮苷对烟熏所致的豚鼠慢性病理性咳嗽及卵白蛋白（OVA，ovalbumin）介导的豚鼠咳嗽变异性哮喘具有显著作用，柚皮苷能显著抑制大鼠气道黏蛋白的合成与分泌以及气道上皮杯状细胞的增生。本文综述了呼吸道平滑肌张力收缩调控机制、咳嗽变异性哮喘疾病及治疗研究进展、呼吸道上皮浆液分泌调控机制，以及柚皮苷对呼吸道张力收缩及浆液分泌的调控机制研究进展，为其临床应用提供思路与依据。

1 呼吸道平滑肌张力收缩调控机制

气道直径和气流阻力与呼吸道平滑肌细胞的活性密切相关，平滑肌细胞可以通过抵抗外加负荷维持呼吸道容积的稳定性，控制肺死腔的大小以协助肺部收缩，呼出气体和异物，调整呼吸道直径，并适应咳嗽［1］。

1.1 呼吸道平滑肌细胞收缩机制

呼吸道平滑肌细胞以“肌丝滑动”原理进行收缩，在收缩过程中平滑肌细胞胞内Ca2+浓度是调控收缩的关键因素，它能和钙调蛋白结合，进一步调控收缩过程［2-3］。胞内Ca2+浓度的增加依赖于钙库中Ca2+的释放以及胞外离子经Ca2+通道的转运［2］。质膜受体被信号分子激活，经G 蛋白偶联受体调控IP3/DAG下游通路，激活钙库上Ca2+通道及蛋白激酶C（PKC），通过钙库中Ca2+释放及PKC级联反应升高胞内Ca2+浓度；信号分子也可激活膜上离子通道，诱导动作电位产生，引起质膜去极化，激活电压门控Ca2+离子通道（VOCC，voltagegated calcium channel）等，引起胞外Ca2+内流，升高胞内Ca2+浓度，产生收缩效应［4］。

1.2 呼吸道平滑肌细胞舒张机制

平滑肌细胞的舒张方式可分为：上皮依赖和非上皮依赖。胞内Ca2+浓度降低引起肌球蛋白轻链激酶（MLCK）失活，同时激活肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP），进一步导致平滑肌舒张。

1.2.1 上皮依赖研究发现上皮能够缓解平滑肌收缩。上皮能够释放PGE2、NO 等上皮源舒张因子（EpDFR）调控平滑肌舒张［5-6］。上皮对平滑肌的舒张作用主要通过鸟苷酸（GMP）途径，鸟苷酸环化酶（GC）分布于质膜和胞质中，NO 和硝基类物质激活胞浆中的GC，心房利钠肽（ANP）激活质膜上的GC。通过上皮释放的舒张因子激活GC，使之催化GTP 形成cGMP，进一步激活钾离子通道引起质膜超极化的同时促进Ca2+进入钙库降低其浓度，此外cGMP 依赖的激酶能够改变MLCK、MLCP的活性达到舒张作用。

1.2.2 非上皮依赖呼吸道平滑肌细胞移除胞内Ca2+的机制主要包括：cAMP 途径和激活阳离子通道途径。cAMP 途径：信号分子引起胞内cAMP 浓度增加，进一步活化蛋白激酶A（PKA），调控下游通路舒张平滑肌。这些影响主要包括：抑制磷酸肌醇水解为IP3；增加内质网和线粒体的Ca2+摄取；使MLCK 失活；激活细胞质膜上的阳离子通道和转运体引起膜超极化等。激活阳离子通道途径：能使质膜超极化，阻碍电压门控钙离子通道（VGCC）开放；激活钠钾泵（Na+/K+-ATPase），降低胞内钠离子，促进钠钙交换体（NCX）运作；调节并影响胞内Ca2+的释放［7］。总的来说，激活钾离子通道使膜超极化和拮抗钙通道阻止钙内流是主要的两个舒张途径［2，8］。

2 大电导钙激活钾离子通道介导的呼吸道平滑肌张力收缩调控作用

阳离子通道中钾离子通道对平滑肌细胞电稳定影响非常大，钾离子通道（potassium ion channel）是指通透特异性仅允许K+通过质膜的通道。当K+通道被激活后，引起K+外流，胞内降低的K+浓度引起呼吸道平滑肌细胞超极化，阻碍电压门控Ca2+通道，同时激活钠钙交换体运作降低胞内钠离子，促进Ca2+浓度降低，抑制气道平滑肌收缩，进而促进呼吸道平滑肌舒张，降低气道组织张力。

大电导钾离子通道（BK）和ATP 敏感钾离子通道（KATP）是机体中起主要作用的两类K+通道。BK 被胞内信使cAMP、cGMP 和钙升高所激活，被蝎毒素（IbTX）所抑制［7，9］；ATP 敏感的K+通道被胞内ATP 的降低所激活，被磺脲类药物如格列本脲（Glibenclamide）所抑制［10-11］。

大电导钙激活钾离子通道（BKCa，largeconductance Ca2+-activated K+channel）中K+转运孔道由4个相同的α 亚基组成［12］，同时还有一个β 亚基调控通道活性。每个α 亚基由7 个跨膜片段（S0～S6）组成［13-14］，其中S1～S6 片段与其他电压门控钾离子通道的S1～S6 片段类似；S5、S6 片段形成选择性通透K+的孔道；S4 片段存在电压敏感区域，通过其中的一系列带电残基感测跨膜电压；相对独立的S0 片段为通道提供胞外的N 末端［13-16］，并与β1 亚基形成重要的相互作用［17-21］。每个通道α亚基的剩余部分由一对串联的K+电导调节器片段组成，该结构域形成通道的胞质Ca2+传感器［22-25］。平滑肌细胞BK 通道共表达β1 亚基，有助于增强表观Ca2+敏感性［26-32］。

BKCa能够被胞内Ca2+浓度和质膜去极化协同激活，产生外向K+大电流使得细胞膜快速超极化，进而恢复膜电位稳定［33-35］。BKCa在细胞生理学功能中起着连接胞质钙离子信号和质膜电信号的作用，其结构功能的异常会引起多种疾病［27，36-42］。

3 咳嗽变异性哮喘疾病及治疗研究进展

随着临床研究的深入，发现很多呼吸系统疾病都与平滑肌细胞结构功能改变相关。从收缩表型，逐渐转变为增殖、合成和分泌型，通过细胞结构的改变对呼吸功能产生严重影响。由于病毒细菌的侵入，产生呼吸道损伤，平滑肌自我修复功能增强，凋亡减少数目增多引起收缩张力增强，产生呼吸道平滑肌强直收缩，表现为哮喘、呼吸窘迫等症状。此外平滑肌收缩蛋白及激酶表达发生变化，对外界刺激产生的收缩反应更敏感，因此很弱的刺激都能引发呼吸道明显的收缩现象，表现为咳嗽等症状。从细胞结构和功能上表现为骨架蛋白和收缩蛋白结构的重排、K+通道活性的降低以及Ca2+通道活性的增强，引起细胞收缩张力的增加以及兴奋阈值的降低，从而产生高强直收缩及气道高反应性等异常收缩特性，以此产生更早更强烈的收缩反应同时对抗生理舒张物质的调控，表现为咳嗽敏感性增加、哮喘等症状。

咳嗽变异性哮喘（CVA，cough variant asthma）是一种变异形式的哮喘，强烈刺激性干咳是其唯一临床表现，一般持续6～8 周，30%～40%的患者可能发展为典型哮喘［43-46］。CVA 患者虽然没有气喘、气促等症状，但表现出气道高反应性，并对舒张呼吸道平滑肌的支气管扩张剂表现出显著反应［47-51］。靶向作用于呼吸道平滑肌的支气管扩张剂是目前临床治疗CVA 常用的有效策略，通过舒张平滑肌，调节呼吸道张力，起到治疗的作用。对呼吸道平滑肌具有舒张作用的药物对CVA 疾病均有一定的治疗效果［47，50］。因为BKCa通道可以介导较大的外向K+电流，引起呼吸道平滑肌超极化，舒张平滑肌［52-53］，因此BKCa通道是调节支气管舒张过程中常用的药物靶点［7］。针对于支气管收缩异常，最常见的治疗方法是激活BKCa通道。

近年来，开发小分子靶点支气管扩张剂的研究正在兴起，天然产物作为丰富的化合物资源库，是CVA治疗的有效策略，其研究广受关注。

4 呼吸道上皮浆液分泌调控机制

覆盖在呼吸道表面具有黏附功能的呼吸道表面液体（ASL，airway surface liquid）在机体防御功能中发挥重要作用。ASL 分为黏液层（ML，mucus layer）和纤毛周液层（PCL，periciliary fluid layer），具有黏性的ML 覆盖在与上皮细胞接触的PCL上［54］。ML 约厚5～10 μm，含有大量的水、盐、黏膜下腺体及杯状细胞分泌的黏蛋白等物质，具有一定黏弹性，能够捕捉吸入的异物，黏蛋白含量决定了ASL的黏稠度。同时ML中含有大量防御素能够抑制细菌增长，保护机体。PCL 由呼吸道上皮细胞和黏膜下腺体分泌，因含水量较高而具有较ML低的黏度，因此具有流动性，是纤毛清除呼吸道尘埃和细菌的介质。PCL 约厚6 μm，高度与纤毛一致，纤毛穿过PCL 后尖端接触到黏液层，通过定向摆动能够有效地带动ML流动，排出黏附的粉尘细菌等异物。ASL 的深度、成分和黏度是纤毛清除、杀菌活性、上皮细胞和免疫细胞功能的重要决定因素［54］。

按照分泌部位和黏蛋白含量的不同，在临床上又将气道分泌液分为浆液和黏液，对应ASL，浆液即为PCL 由上皮细胞和黏膜下腺体分泌，黏液即为ML由杯状细胞及腺体分泌。黏膜下腺体中的浆液细胞处于腺泡结构最远端，能够分泌Cl-和，引起浆液分泌增加，分泌的浆液是黏液流动排出的载体。在浆液分泌过程中离子转运所引起的渗透压改变起着至关重要的作用，其中Cl-占主要地位，通过离子转运体将胞内离子定向排出到细胞顶膜面引起渗透压梯度改变，从而引起水分通过细胞旁路以及水通道蛋白（AQPs）发生自渗透压低浓度向高浓度的定向扩散，完成浆液分泌过程。由此可知，Cl-通道和AQPs对呼吸道浆液分泌起重要地位，由于Cl-浓度的改变才能引起水分经AQPs 的转运，因此Cl-通道的活性及表达对于浆液分泌来说占主导地位。

5 囊性纤维化跨膜传导调节蛋白介导的呼吸道上皮浆液分泌调控作用

离子通道、转运蛋白以及质子泵位于上皮细胞顶膜面和基底膜面上，共同决定了电解质的吸收和分泌以及上皮细胞分泌的液体体积。Cl-分泌吸收对于呼吸道浆液调控起着关键作用，呼吸道上皮细胞存在Cl-的双向流动，细胞间Cl-通透性较大，顶膜面分布着囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR，cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）和Ca2+激活Cl-通道（CaCC，Ca2+-activated Cl-channel），基底膜主要由钠钾氯共转运体（NKCC，sodium potassium chloride cotransporter）组成。NKCC 将Cl-经基底膜转运入胞内，引起胞内Cl-浓度增加，Cl-顺浓度梯度扩散至顶膜面，经顶膜面CFTR 及CaCC 排出细胞，完成Cl-定向跨膜分泌过程。此时基底膜面的Na+经钠钾泵（Na+/K+-ATPase）转运排出胞外，以维持胞内Na+低浓度，为底膜Cl-吸收提供能量。K+经基底膜面K+通道排出胞外，建立了电化学梯度，为Cl-从顶膜排出提供动力。顶膜面分泌的Cl-增加引起渗透压梯度改变，从而引起水分通过细胞旁路以及AQPs 发生自渗透压低浓度向高浓度的定向扩散，完成浆液分泌过程［55］。

呼吸道上皮细胞顶膜面CFTR 是Cl-分泌的主要通路，是电解质转运和液体分泌的关键通道［56］。CFTR 主要表达在黏膜下腺的浆液细胞顶膜面，由1 480个氨基酸组成，共形成5个区域，包括2个跨膜区，其中各区由6 个跨膜段组成［57］。CFTR 能够被cAMP 依赖的PKA 的共价修饰，使得功能活化，具有分泌Cl-的功能和对上皮钠离子通道（ENaC，epithelial sodium channel）活性的调控功能。同时，CFTR 508位丝氨酸的磷酸化程度能够调控其活性，决定分泌效率。PKA 能够将CFTR 中508 位的丝氨酸磷酸化，进而调控CFTR 活性。胞内cAMP 浓度增加可以激活PKA，而cAMP 浓度降低后CFTR 随即失活，因此胞内cAMP 浓度是调控CFTR 功能的重要靶点。腺苷酸环化酶（AC，adenylate cyclase）能够增加cAMP 合成，提高其浓度；磷酸二酯酶（PDE，phosphodiesterase） 能够降解胞内cAMP，降低其浓度。因此药物能够调节AC 或是PDE的活性就能调控CFTR 功能，影响呼吸道浆液分泌。此外，在一些种属中，cAMP 浓度的增加可以促进含有CFTR 的囊泡与细胞膜结合，提高膜蛋白表达，增加通道密度，增大分泌量。合成的CFTR 与其他膜蛋白类似，能够由内质网通过囊泡分泌结合到细胞顶膜面，又能够在某些刺激时由顶膜面脱落结合至内质网，或经溶酶体降解。因此对于CFTR，从cAMP 浓度依赖的功能上，还是从蛋白表达结合上，都能多角度调节上皮细胞顶膜面Cl-分泌，影响浆液分泌。

6 脂多糖及PM2.5对呼吸道浆液分泌的影响

呼吸道浆液分泌异常是临床呼吸系统发病率增加、病程加剧的主要诱因。其分泌功能异常会导致痰液分泌增加，产生咽炎、肺炎及肺癌等疾病。当浆液分泌减少时，纤毛运动受阻，黏液无法排出，痰液分泌增加积累在气道，其中黏附的细菌微生物不断增殖，引起组织炎症，加重呼吸道疾病症状，进而引起肺炎等疾病，长期发展容易造成肺癌，危及人体健康。同时诱发的各种炎症因子、污染物粉尘颗粒、细菌病毒等又会刺激上皮细胞，降低某些离子转运体功能，抑制转录表达，或是增加受体敏感性，进一步抑制浆液分泌，从多角度损伤呼吸系统生理功能。研究表明多种外界刺激［58-59］可抑制呼吸道上皮细胞CFTR与AQPs表达，不仅能够抑制mRNA 转录，降低蛋白翻译，还能诱导已结合的CFTR 从质膜上脱落，减少膜蛋白结合数量，从而减弱细胞渗透性，降低浆液分泌体积，影响呼吸系统正常生理功能。在CFTR mRNA 表达过程中，调控受多种因素影响，如miR-138 （一种microRNA） 的丰度［60］，NF-κB 的 激 活［61］，经JAK/STAT 通 路 而 激 活 的JAK2［62］以及血管升压素（vasopressin）的活性［63］等。Akt是CFTR 合成中信号转导的关键介质［64-65］，脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）可以结合Toll 样受体4（TLR4，Toll-like receptor 4）并磷酸化Akt来激活phosphoinositide3-kinase（PI3K）-Akt 通路，从而导致CFTR 表达下调［66-67］。针对于此，LY294002（a PI3K/Akt 抑制剂）可以消除这种影响［67］。此外，CFTR表达异常被认为是一种广泛存在于白种人中的遗传性疾病——囊性纤维化疾病（CF，cystic fibrosis）的主要原因［68］。虽然顶膜面的CaCC 能够一定程度地补偿CFTR 缺失造成的损伤，在CF疾病中CaCC活性上调，能够弥补CFTR介导的Cl-分泌，但是这种轻度外线整流Cl-通道与CFTR相比作用仍显得很弱。因此对于CFTR来说，功能或是表达的损伤对呼吸道浆液分泌都会产生严重影响。

6.1 脂多糖的影响

脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁中的有毒物质。在呼吸系统中，LPS 能够诱导炎性介质分泌并激活炎症通路，产生组织炎症［69］；同时活化MAPKs信号通路，诱导黏蛋白分泌增加，引起痰液黏稠，影响痰液排出［70］。此外，LPS 还可以结合TLR4并通过磷酸化Akt 激活phosphoinositide3-kinase（PI3K）-Akt 通路，从而导致CFTR 表达下调［66-67］，使得呼吸道浆液分泌减少，纤毛摆动受阻，加重组织炎症反应。可以看出，LPS不仅能够增加黏蛋白分泌，还能减少CFTR 表达，从黏液分泌和浆液分泌两个角度影响呼吸道分泌功能，产生痰液增多及炎症等病症。

6.2 PM2.5的影响

细颗粒物（PM2.5）是评价大气污染的重要标志，它与呼吸系统疾病的发病率及死亡率密切相关［71-74］。通过评估PM2.5暴露所引起的相对风险，发现PM2.5更容易引起成人局部缺血性心脏病、慢性阻塞性肺病、肺癌及中风；而对于5岁以下的儿童而言，急性下呼吸道感染的风险则会更高［74-76］。Global Burden of Disease 的研究认为，仅在2010 年全球就有超过300 万人因PM2.5所引起的各种疾病而过早死亡［77］。在中国，PM2.5每年会引起120 万人死亡，PM2.5污染是造成死亡的第四大危险因素，超过55 岁后慢性呼吸系统疾病致死率会随着年龄的增长而越来越高［78］。呼吸系统疾病的发病率随着PM2.5污染的加重而逐年增加，故研究抗PM2.5所致肺损伤的治疗药物及其作用机制，很有必要。

PM2.5粒径微小，能够通过损伤呼吸道黏膜上皮细胞，沉积在肺泡内或肺间质内，激活肺内的免疫细胞，引起气道炎性反应、氧化损伤、肺泡上皮细胞DNA 损伤、周期阻滞及细胞凋亡，最终造成肺损伤［79-88］。近期研究表明：①PM2.5通过影响TRPA1 和TRPV1 表达，上调小鼠OVA 敏感性，增加气道阻力和肺顺应性，恶化哮喘发病症状［89］；②PM2.5能够上调黏蛋白MUC4 与MUC5AC 表达，增加浆液分泌黏性［90-91］；③PM2.5能够通过激活TLR4/MyD88通路及NLRP3炎症小体诱导IL-1β分泌，并在升高肺组织巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸细胞活化趋化因子、IL-5 水平的同时，增加小鼠肺泡灌洗液及血液中IL-6和TNFα水平，引起呼吸系统及全身炎症反应［92-94］；④PM2.5能够在升高肺组织LDH 及ROS 的同时降低肺上皮细胞CAT 与SOD 活性，并引起细胞自噬，产生组织氧化损伤［95-96］。可以看出，PM2.5对肺的损伤是多方面的，既影响肺功能，又影响呼吸道浆液及黏液分泌，还会引起组织炎症及氧化损伤。

7 柚皮苷的药理研究进展

7.1 柚皮苷的镇咳、祛痰、消炎作用

7.1.1 镇咳作用方面柚皮苷的镇咳机制与KATP 开放、C 纤维和P 物质释放无关，而是通过抑制RARs放电进而产生外周性镇咳；柚皮苷能够显著抑制烟熏所致豚鼠慢性病理性咳嗽及OVA 介导的豚鼠CVA疾病［97-99］。

7.1.2 祛痰作用方面柚皮苷对痰液中的黏液成分与浆液成分均具有调节作用。一方面，能显著抑制LPS 和EGF 诱导的气道黏蛋白的合成、分泌以及气道上皮杯状细胞的增生；另一方面，它能通过活化气道上皮细胞基顶膜CFTR 的表达与功能，促进Cl-分泌到气道腔，进而通过渗透压活化AQPs 促进气道内浆液分泌，同时上调LPS 抑制的AQP1与AQP5表达［100-102］。

7.1.3 消炎作用方面柚皮苷对LPS 诱导的急性肺部炎症、CS 暴露诱导的慢性气道炎症均具有很好的抑制作用，不仅对LPS 诱导的急性肺损伤小鼠急性气道炎症有显著抑制效果，还可以显著抑制烟熏诱导的COPD大鼠及豚鼠慢性气道炎症、黏液高分泌、咳嗽高反应性及气道高反应性等COPD典型症状，并且其对慢性气道炎症的抑制作用与气道中促炎症消退介质LXA4含量呈正相关；一方面，柚皮苷显著抑制BALF 中促炎因子IL-8 水平、减少中性粒细胞浸润，同时抑制抗炎因子IL-10 的降低，促进ALX 受体表达；另一方面，柚皮苷具有一定促进炎症消退的作用，可以通过调控NO 释放和同型半胱氨酸代谢促进炎症消退，在此过程中Arg1、Bhmt、Gnmt等可能是药物抗炎的作用靶点［98-99，103-108］。

7.2 柚皮苷主要代谢产物柚皮素对呼吸道张力收缩及浆液分泌的调控机制研究进展

7.2.1 在呼吸道张力收缩调控方面柚皮苷在体内代谢为柚皮素，能激活大鼠结肠平滑肌BKCa通道，引起细胞膜超极化，减少Ca2+内流，从而对大鼠结肠平滑肌产生舒张效应［109］。同样的，柚皮素能够剂量依赖地激活血管平滑肌细胞BKCa通道，产生舒张血管的作用，柚皮苷与其作用一致，但是舒张效果较弱［110］。此外，柚皮素还能增加HEK293T细胞中BKCa通道活性［111］。以上结果可以提示柚皮苷和柚皮素可能通过调控呼吸道平滑肌BKCa通道介导的超极化状态，调节呼吸道平滑肌收缩，产生舒张作用。然而目前没有针对呼吸道平滑肌研究柚皮苷对BKCa通道的调控作用，鉴于不同部位组织结构功能差异，此研究十分必要。

我们构建了CCh 和KCl 诱导的体外呼吸道张力收缩异常疾病病理模型，考察了柚皮素对呼吸道张力和平滑肌胞内Ca2+浓度的影响。柚皮素主要通过激活BKCa通道直接舒张呼吸道平滑肌，引起平滑肌细胞膜超极化，降低胞内Ca2+浓度，产生呼吸道舒张作用。这一研究结果科学阐释了柚皮素对呼吸道平滑肌张力变化的调控作用及机制，为柚皮素在呼吸系统疾病CVA 中的临床应用提供了实验数据与理论依据。

因柚皮素能够抑制CVA 豚鼠咳嗽次数及气道高反应性，提示柚皮素对呼吸道平滑肌具有调控作用，能够降低呼吸道张力，舒张呼吸道平滑肌。我们从组织与细胞两个层面分别考察柚皮素对呼吸道平滑肌张力变化的影响。在考察对组织张力收缩的调控作用时，使用CCh 诱导呼吸道张力收缩模型，通过去除上皮，使用离子通道抑制剂等方法，筛选了柚皮素对呼吸道平滑肌的作用通路；在考察对胞内Ca2+浓度的调控作用时，分别使用CCh 及高浓度KCl 诱导胞内Ca2+浓度升高模型，通过离子通道抑制剂对组织舒张实验结果进行验证，从细胞层面揭示药物舒张作用机制。

在采用CCh 诱导呼吸道张力收缩模型研究柚皮素对组织张力收缩的调控作用时，使用肌张力测定系统检测急性分离的呼吸道组织张力变化。研究结果表明：柚皮素能够剂量依赖性地降低CCh 诱导的呼吸道张力增加，恢复组织舒张状态；柚皮素引起的呼吸道舒张作用不受上皮调控，直接作用于呼吸道平滑肌，是一种非上皮依赖的舒张效应；柚皮素产生的舒张作用主要由BKCa通道介导，通过激活BKCa通道引起平滑肌细胞膜超极化，产生舒张效应。

在采用CCh及高浓度KCl诱导胞内Ca2+浓度升高模型研究柚皮素对胞内Ca2+浓度的调控作用时，使用实时定量Ca2+成像系统检测原代培养呼吸道平滑肌细胞胞内Ca2+浓度变化。研究结果表明：柚皮素能够降低CCh及高浓度KCl诱导的胞内Ca2+浓度升高，恢复胞内Ca2+浓度水平；柚皮素产生的Ca2+浓度调控作用受BKCa通道影响；柚皮素主要通过激活BKCa通道开放，引起K+外流，胞内降低的K+浓度引起呼吸道平滑肌细胞超极化，阻碍电压门控Ca2+通道，激活钠钙交换体运作，促进Ca2+浓度降低，抑制气道平滑肌收缩，进而促进呼吸道平滑肌舒张，降低气道组织张力。

以上研究结果系统解释了柚皮苷调节呼吸道平滑肌张力的作用与机制，为其在临床CVA 疾病治疗中的应用提供了实验数据与理论依据。

7.2.2 在呼吸道浆液分泌调控方面柚皮苷能显著抑制LPS 和EGF 诱导的气道黏蛋白的合成与分泌以及气道上皮杯状细胞的增生，调控痰液黏稠度。然而柚皮苷对呼吸道浆液分泌的调控作用还是一个空白，目前没有研究从CFTR 功能、表达，以及AQPs 表达的角度分析柚皮苷祛痰的药理活性，我们考察了柚皮苷/柚皮素对上皮浆液分泌的调控作用，为揭示柚皮苷祛痰的药理活性及其临床研究与应用提供理论依据。

我们构建了LPS 与PM2.5诱导的体内、外呼吸道浆液分泌异常疾病病理模型，考察了柚皮素对呼吸道浆液分泌离子转运和通道表达的影响。结果表明柚皮素能通过增加胞内cAMP 浓度，激活CFTR 通道，引起Cl-定向转运，促进水分转运浆液分泌，恢复LPS 和PM2.5损伤的呼吸道CFTR、AQP1、AQP5 表达，降低溶菌酶及蛋白质浓度，改善浆液黏稠度，同时调节LPS 与PM2.5所致的浆液分泌异常。这一研究结果科学阐释了柚皮苷对呼吸道上皮浆液分泌的调控作用及机制，为其在呼吸系统疾病中的应用提供了依据。

祛痰作用包括对黏液分泌调控和浆液分泌调控两个方面，本团队前期已证实柚皮苷能显著抑制LPS 和EGF 诱导的气道黏蛋白的合成与分泌以及气道上皮杯状细胞的增生，但柚皮苷对浆液分泌的调控机制还是一个空白点。我们从动物、组织与细胞3 个层面分别考察柚皮苷/柚皮素对呼吸道浆液分泌的影响。在考察对呼吸道上皮Cl-转运的调控作用时，采用急性分离大鼠呼吸道组织，通过短路电流技术，使用离子通道抑制剂等方法，筛选了药物对呼吸道上皮Cl-转运的作用通路，验证了药物调控机制；在考察药物对LPS 与PM2.5诱导的体内、外呼吸系统疾病的影响时，分别使用LPS 与PM2.5诱导浆液分泌异常模型，通过气液分界培养，分泌浆液检查等分子生物学检测技术，研究了药物对LPS 与PM2.5诱导浆液分泌异常的调控作用。

在采用急性分离的大鼠呼吸道组织研究柚皮素对呼吸道离子转运的调控作用时，使用短路电流及Elisa 技术检测呼吸道组织Cl-转运及cAMP 浓度变化。研究结果表明：柚皮素能够增加呼吸道上皮细胞胞内cAMP 浓度，激活顶膜面CFTR 通道，引起Cl-分泌，基底膜面NKCC 和K+通道参与调控此过程；通过基底膜面NKCC 吸收及顶膜面CFTR 分泌定向转运Cl-，柚皮素能够增加Cl-跨上皮分泌，促进水分转运浆液分泌。

在采用LPS 及PM2.5诱导呼吸道上皮细胞浆液分泌异常模型研究柚皮素对离子浆液转运分泌功能及通道表达的影响时，使用气液分界培养、qRT-PCR 及Elisa 技术，检测呼吸道上皮细胞浆液分泌Na+、Cl-、溶菌酶、蛋白质浓度，胞内cAMP浓度以及CFTR、AQP1 与AQP5 基因表达的变化。研究结果表明：LPS及PM2.5可诱导呼吸道上皮细胞浆液分泌异常；柚皮素增加呼吸道浆液分泌，在激活CFTR功能的同时降低LPS及PM2.5诱导的溶菌酶及蛋白质高分泌，增加Na+、Cl-分泌，且升高细胞受LPS 及PM2.5诱导所致的CFTR、AQP1 与AQP5 mRNA 及蛋白低表达；柚皮素具有改善LPS 及PM2.5诱导的呼吸道上皮细胞浆液分泌异常的作用。

在采用PM2.5诱导BALB/c 小鼠肺水肿模型研究柚皮苷对PM2.5致小鼠呼吸道浆液分泌异常的影响时，使用小鼠肺组织滴注、组织干湿重测定、qRT-PCR 及Elisa 技术，检测肺组织干湿重比、黏蛋白与总蛋白分泌量以及肺组织CFTR、AQP1 与AQP5基因表达的变化。研究结果表明：PM2.5能够诱导小鼠肺损伤，产生肺水肿；柚皮苷能够减弱PM2.5诱导的小鼠肺水肿，降低总蛋白分泌，改善浆液黏度。

总之，上述研究填补了国内外柚皮苷相关作用机制的研究空白，为临床应用提供了理论和实验依据，为创新药物的研发提供了思路。