免疫检查点抑制剂相关心肌炎分子机制研究进展

陈怡帆，程蕾蕾，葛均波*

1. 复旦大学附属中山医院心内科，上海市心血管病研究所，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院心脏超声诊断科，上海市心血管病研究所，上海市影像医学研究所，上海 200032

随着肿瘤诊疗手段的发展，以免疫治疗为代表的新型恶性肿瘤治疗模式已显示出其巨大的优势和潜力。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）［1］是目前效果最佳、应用最广的免疫制剂，但免疫检查点功能的阻断也可导致免疫耐受失调，诱发免疫相关不良事件（immunerelated adverse events, irAEs）［2］。其中ICIs相关的心肌炎（immune checkpoint inhibitor-associated myocarditis, ICIAM）发生率为0.21%～3.30%，但死亡率高达27%～67%，居irAE之首［3-5］。因致死率高、机制复杂，其诊疗已成为临床医生和药学专家的共同挑战。近年来，导致ICIAM的新分子机制被不断提出，本文就ICIAM的分子机制进展进行综述。

1 ICIs的主要分类及代表药物

免疫检查点由CD8＋T细胞上的受体和肿瘤细胞上相应的配体组成。ICIs是能结合免疫检查点或其配体的抗体，目前已投入使用的有外周血细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）抑制剂、程序性细胞死亡蛋白1（programmed death protein-1/ligand-1，PD-1/PD-L1）抑制剂和淋巴细胞活化基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）抑制剂［1,6］。

CTLA-4抑制剂阻断CTLA-4（CD152）和其配体B7-1/B7-2（CD80/CD86）结合导致的T细胞肿瘤免疫应答能力下降［7］。2011年至今，美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了伊匹木单抗（Ipilimumab）和替西木单抗（Tremelimumab）2种人源化CTLA-4单抗上市，用于治疗晚期黑素瘤和卵巢癌［8］，并正在非小细胞肺癌患者中进行临床试验［7］。

PD-1/PD-L1抑制剂阻断PD-1（CD279）与其抑制性配体PD-L1（CD274）结合，恢复T细胞肿瘤杀伤能力［9］。自2014年首个PD-1抑制剂帕博利珠单抗（Pembrolizumab）获FDA批准后，先后有帕博利珠单抗（Pembrolizumab）、纳武利尤单抗（Nivolumab）、阿特朱单抗（Atezolizumab）、阿维鲁单抗（Avelumab）和度伐利尤单抗（Durvalumab）5种人源化PD-1/PD-L1单抗投入到黑素瘤、霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、胃癌、肾细胞癌、尿路上皮癌、梅克尔细胞癌的免疫治疗中［10］。

LAG-3抑制剂可逆转LAG-3和MHC Ⅱ类分子诱导的T细胞耗竭［6］。LAG-3抗体IMP321以及PD-1/LAG-3双特异性抗体FS118已进入治疗B细胞淋巴瘤和三阴性乳腺癌的临床试验［11-12］。

2 ICIs与心肌炎的关系

目前没有证据证实各类ICIs导致的ICIAM的病理类型存在显著差异。对发生ICIAM的动物或患者行心内膜下心肌活检或尸检，多可见以CD3＋T 细胞为主的大量淋巴细胞浸润，此外还有少数 CD8＋T细胞、CD4＋T细胞、CD68＋巨噬细胞和嗜酸粒细胞浸润［2,13-14］。

单独使用PD-1/PD-L1抑制剂的ICIAM的发病率为0.05%～0.38%［1,14］，而仅用CTLA-4抑制剂则有更高的发病率，为0.06%～1.08%［2］。两种ICIs联合治疗时ICIAM的发病率约为单药治疗的1.4～5倍［2］，不同种类的CTLA-4抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂联合用药导致的ICIAM的发生率为0.27%～5.71%［1-2,5,14］。

3 ICIAM分子机制

3.1 肿瘤同源抗原的异位识别 正常组织和肿瘤细胞间存在某些高度同源的抗原或表位，ICIs上调的免疫反应可能导致肿瘤同源抗原的异位识别［14］。

Mahmood等［15］对11例ICIAM患者进行心脏活检或尸检发现了T细胞为主的淋巴细胞浸润，推测其中包含导致组织损伤的自身反应性T细胞。Johnson等［14］对抗CTLA-4和抗PD-1联合治疗且发生ICIAM者的尸检显示，心肌和肿瘤中浸润T细胞共有的高度克隆扩增的TCR显示二者中存在由相同的T细胞克隆识别的抗原；全转录组测序发现心肌中炎症性T细胞因子、肿瘤中肌肉特异性抗原（结蛋白和肌钙蛋白抗原）的表达均增加。

以上研究共同说明，ICIAM的发生可能是由于T细胞在心肌和肿瘤组织间中识别了相同的抗原，或是T细胞交叉识别了具有足够的同源性的不同抗原。

3.2 阻断免疫检查点的心脏保护作用 心肌细胞的损伤和死亡可使心脏抗原暴露于T细胞，促进T细胞介导的炎症反应。正常人体内，免疫检查点可调控该反应的剧烈程度，称为心脏的外周免疫耐受（peripheral immune tolerance of the heart）［16］。ICIs破坏了这种免疫耐受的平衡状态，促使“炎症瀑布”趋向恶化。肿瘤免疫治疗使用的几类重要ICIs破坏心脏免疫耐受的分子机制如下。

PD-1抑制剂阻断PD-1结合PD-L1，增强心肌反应性T细胞活性并协调其对心脏的攻击［16］。Johnson等［14］分析了2例ICIs导致的致死性暴发性心肌炎后指出，ICIAM中PD-L1的表达具有心肌组织特异性，在骨骼肌细胞或肿瘤细胞上无表达。Baban等［17］发现，PD-L1在受损心肌中的上调是一种细胞因子诱导的保护机制。Grabie等［18］对小鼠ICIAM的分子病理学研究阐明了PD-L1和MHC Ⅱ类分子在以上机制中的作用，在正常心脏中，心脏抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）杀伤心肌细胞并分泌IFN-γ，IFN-γ诱导邻近心肌细胞PD-L1和MHC Ⅱ上调，PD-L1使其他同类CTL的激活受抑制，而MHC Ⅱ则导致心脏抗原特异性辅助型T（Th）细胞的活化，从而促进炎症和巨噬细胞活化，损伤心肌。因此，抗PD-1/PD-L1治疗后，失去限制的CTL激活更加剧了心肌损伤。

免疫检查点的阻断可能加剧了免疫细胞向心脏的浸润，且CTLA-4抑制剂较PD-1抑制剂更可能诱发irAE［19］，其导致ICIAM的主要机制可归纳为：（1）干扰CTLA-4结合B7-1/B7-2等共刺激分子，使心脏抗原特异性T细胞活化阈值降 低［20］；（2）破坏CTLA-4调节性T细胞（Treg）内在的抑制信号，增强各类反应性T细胞活化［20］；（3）增强已产生的心脏抗原特异性记忆T细胞再激活［21］。

此外，LAG-3缺失也被证明会损害自身免疫炎症部位Treg细胞功能［11-12］，为LAG-3抑制剂诱发ICIAM提供了假说。免疫检查点作为T细胞入侵时的抑制信号，下调心脏应激和疾病状态下T细胞相关炎症反应，ICIs却阻断了这一保护作用，增加了ICIAM发展为致命性心肌炎的概率。

3.3 炎症因子的增加及信号通路的变化 ICIs促使循环炎症因子增加，当其在心肌等脱靶（offtarget）组织中累积到一定阈值后可引发ICIAM［22］。Ono等［23］基于小鼠的研究证明，心肌炎中CD4＋T细胞处于多个Treg亚群控制之下，它们以表达FoxP3（forkheadboxp3）转录因子和激素性肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor, GITR）为特征。随后，Ji等［25］对伊匹木单抗和纳武利尤单抗联合治疗的食蟹猴心肌组织及循环炎症因子分析表明：（1）T细胞的活化、增殖与血液中IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、INF-γ、TNF-α等细胞因子的增加基本平行；（2）RNA测序（RNAseq）和比对Ingenuity心肌炎基因知识库发现22个在对照和实验组间差异表达的基因，最重要的是与T细胞归巢有关的CXCR3-CXCL9/CXCL10和CCR5/CCL5轴上多种趋化因子受体基因的表达上调。此外还涉及包括数种MHC分 子（HLA-DRA、HLA-DMB、HLA-DPB1），T细胞活化和Th1分化相关基因或标志物（PRKCQ、TNFSF8、CD40配 体、TBX21、STAT4） 和CD8效应分子（PRF1、TNF）的编码基因。Johnson等［14］对暴发性ICIAM者心肌组织的研究也描述了CXCR3-CXCL9/CXCL10和CCR5/CCL5轴相似的变化。

Humblin和Kamphorst［25］发 现CXCR3-CXCL9/ CXCL10轴在炎症反应和肿瘤杀伤中发挥作用，ICI阻断PD-1通路，诱导IFN-γ增加，促使CD103＋树突状细胞产生CXCL9/CXCL10趋化因子，增强肿瘤微环境中CXCR3 CD8＋T细胞的募集，不断扩增的CXCR3 CD8＋T细胞产生更多IFN-γ，并增殖和分化为颗粒酶B（GamB），杀伤肿瘤细胞。

Donatella等［26］的研究展示了CCR5/CCL5轴也参与炎症反应调控，但主要起促进肿瘤进展的作用，CCR5是一种7次跨膜的G蛋白耦联受体，CCL5是其亲和力较高的配体，二者结合激活G蛋白并活化下游各类信号转导级联通路，如蛋白激酶B（protein kinase B, PKB）和NF-κB通路，诱导细胞骨骼重排和趋化细胞迁移，引导T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞等细胞到达炎症部 位。Lu等［27］指 出ICIAM患 者CCR2、CCR5水平升高，促进骨髓粒细胞巨噬细胞祖细胞迁移入血，分化为单核/巨噬细胞，产生IL-1β，IL-6和TNF-α等循环炎症因子。

Rafael等［28］先从自身免疫性心肌炎小鼠中发现了心肌肌球蛋白特异性的17型Th（Th17）显著增加，并通过miRNA微阵列分析从中鉴定了一种可作为心肌炎标志物的新型miRNA（mmumiR-721），并确定了其人类同源物（hsa-miRChr8:96），可以为ICIAM的分子原理和分子诊断提供参考。

李 政 等［29］对ICIAM患 者 可 溶 性 生 长 刺激表达基因2蛋白（soluble growth stimulation expressed gene 2 protein, sST2）的分析提示其可以作为ICIAM患者的预后预测的有利指标之一。IL-33/ST2通路下游涉及骨髓分化初级反应蛋白88（MyD88）、IL-1受 体 相 关 激 酶（IRAK-1、IRAK-4）和TNF受体相关因子6（TRAF6）等接头分子的募集，进而激活p38 MAPK、c-Jun N端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）和NF-κB等通路，调节IL-4、IL-5、IL-13细胞因子分泌，参与T细胞介导的免疫反应［30］。

ICIAM的发生与复杂的炎症因子和信号通路的变化相关联，对其分子机制的深入探索也成为ICIAM研究的热点之一。

3.4 自身抗体的产生 ICIs可能通过促进针对心肌组织的自身抗体的形成，导致ICIAM等心肌损伤［22］。PD-1缺陷小鼠（MRL背景下）会产生高滴度的心肌肌球蛋白自身抗体和肌钙蛋白I（cTnI）自身抗体，对心肌细胞离子流的研究［31］提示，cTnI抗体通过慢性刺激Ca2＋流入PD-1敲除小鼠心肌细胞引起心功能障碍和心肌扩张。同时，cTnI蛋白编码基因的突变（cTnI-G203S）也是导致家族性肥厚性心肌病（familial hypertrophic cardiomyopathy, FHCM）的分子机制，这点在小鼠与人类中一致。

人类的ICIAM可也表现为扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy, DCM）。目前已从DCM患者的血液中分离出了可与α-（心房特异性）和β-（心室和慢骨骼肌特异性）肌球蛋白重链亚型发生反应的心脏抗原特异性抗肌球蛋白自身抗体和T细胞［32］。Sury等［22］则在接受联合ICIs治疗患者的血液中发现以产生抗体的浆母细胞为代表的特定B细胞群的增加。这些研究也间接提示ICIAM患者血液中或可分离出类似的抗体及细胞。

虽然至今尚未直接从ICIAM患者体内分离出心脏特异性自身抗体，但自身免疫性仍可能是ICIAM病因和进展的重要组成部分，亟待更多强有力的临床证据。

3.5 其他分子机制假说 有假说提示ICIs可能将免疫检查点作为新抗原，直接结合在心肌组织中表达的免疫检查点而导致ICIAM［22］。由于CTLA4和PD-1/PD-L1抑制剂作用于不同的免疫途径和免疫反应的不同阶段，二者导致的irAE也具有多变性。除上文所述CTLA4抑制剂所致irAE严重性高于PD-1/PD-L1抑制剂外，二者“脱靶效应”的高危器官也系统不同，CTLA4抑制剂常导致结肠炎、垂体炎、皮疹，而PD-1/PD-L1抑制剂则为肺炎、甲状腺功能减退、关节痛。以上器官损害主要与刺激经典Ⅱ型和Ⅳ型超敏反应，激活补体和T细胞浸润有关。由此猜测各类器官上不同的免疫检查点作为新抗原结合ICIs，激活补体并导致irAE在器官毒性上的差异。

另一假说根据ICIs介导的结肠炎患者对ICI毒性的敏感性可能由体内微生物群的组成调节，推测其他irAE，包括ICIAM均可能与体内微生物群落组成相关［33］。

以上假说均尚未在人类的ICIAM中得到足够的直接证据，需要进一步的临床和分子病理学研究支持。

4 结论与展望

ICIs通过结合免疫检查点或其特异性配体来恢复机体失衡的肿瘤免疫功能。在给晚期恶性肿瘤治疗提供巨大转变的同时，以ICIAM为代表的irAE也对ICIs的推广产生了较大阻碍。以肿瘤同源抗原的异位识别、免疫检查点心脏保护的阻断、自身抗体和炎症因子的产生为代表的ICIAM分子机制为其临床管理提供了指导。

根据ICIAM中国专家共识（2020版）［34］，使用ICIs者符合以下3个标准中的任意1条即可确诊：心内膜活检符合心肌炎病理表现；心脏核磁共振成像（cardiovascular magnetic resonance，CMR）符合心肌炎特点，伴心肌炎临床表现，且有心肌坏死生物标志物升高或心肌-心包炎的心电图证据中的1条；超声心动图新出现不能用其他诊断解释的室壁运动异常，并同时满足心肌炎临床表现、心肌坏死生物标志物升高、心肌-心包炎心电图证据、血管造影或其他检查排除阻塞性冠状动脉疾病。

确诊ICIAM后除即刻停用ICIs外，应即刻启动一线方案即早期、足量的糖皮质激素治疗［35］，对于亚临床ICIAM，最新观点则提倡“去激素”治疗［36］。若糖皮质激素治疗失败，仍有以下药物可作补救：以吗替麦考霉酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）为代表，抑制T细胞的增殖的二线免疫抑制治疗；抑制T细胞活化因子的钙调磷酸酶抑制剂他克莫司（tacrolimus）；抑制T细胞受体的多克隆抗体抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）；调节抗原呈递细胞（APC）以及Th细胞的免疫球蛋白等［37］。

免疫个体化关闭策略（shut-off strategy）［38］正成为新的焦点，包括针对T细胞浸润的抗IL-6和抗IL-1、抗IL-12、抗IL-23受体；针对B细胞和浆细胞浸润的抗CD20（利妥昔单抗，Rituximab）和抗B细胞激活因子阻断；针对嗜中性和单核细胞浸润的抗TNF-α（英夫利昔单抗，Infliximab）；针对成熟T、B细胞的抗CD52（阿仑单抗，Alemtuzumab）；恢复CTLA-4作用的CTLA-4激动剂（阿巴西普，Abatacept）等治疗逐渐受到各类irAE治疗指南和共识的关注。

综上所述，正确认知和妥善处理诸如ICIAM的严重irAE需要以心血管专家、肿瘤学专家、临床药学专家、护理人员多学科组成的肿瘤心脏病学团队的通力合作, 跨越医学专业的传统界限，努力确保高质量的免疫治疗, 尽可能为癌症患者带来最大获益。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。