食源性病原菌不同检测方法的比较研究进展

陈万义，蒋 飞，邓 睿

常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500

随着全球食品贸易往来的加剧，不同国家或区域对相同基质类型食品的同一病原菌存在不同的标准检测方法；同时各国的标准方法版本也不断地修订与更新[1]，更新前后的标准方法在检测流程上也可能不完全一致。因此，当针对同一病原菌面临多种标准检测方法可供使用时，会对食品生产企业的选择和决策人员产生较大的困扰。当采用不同的标准版本以及使用不同国家的标准方法对相同的产品种类测试时，是否会得到相同或不同的检测结果还没有充分的数据支持。贸易双方都必须对相同产品进行重复检验，加大检测成本并延长了产品的放行时间，从而影响食品进出口贸易的通关效率。

另外，针对某种病原菌定性或定量的食品检测方法选择范围较广，既有国际标准(例如ISO和AOAC组织)，又有国家标准、行业标准、地方标准和团体标准等。针对大多数特定基质类型食品中的微生物检测项目，每个国家或地区均有明确规定的基于传统培养法的政府推荐或官方认可的标准方法。但是，在标准方法(基于培养法)的实际使用过程中存在一定的局限性，如耗时长、成本高等。因此，食品企业为了快速评价食品原料和产品中的微生物含量及加工过程中微生物的控制水平，开始使用一些新的替代检测方法来对食品加工的原辅料和成品进行检测[2]。基于分子生物学或免疫学等新技术研发出的商业化的试剂盒方法，检测时间短且操作步骤更加简便，有些还可以实现自动化出具结果，已经在一些食品检测与质量控制实验室成为替代方法开始使用[3]。这些替代检测方法是否适用企业[4]，需要经过国际权威机构(NordVal、MicroVal、AFNOR(NF Validation)或AOAC)的验证和认可，只有确定和标准方法等效，才可正式作为一种被官方所认可的替代检测方法[5-7]。

基于上述原因，非常有必要开展针对相同食品中同一病原菌的不同标准方法的比较性研究[8-11]，并对方法之间的等效性结果进行科学合理的评估与解释，为食品在全球不同国家之间的进出口贸易的高效放行提供科学有效的数据支撑。微生物的方法验证比较原则有全球范围内公认方法验证标准ISO 16140—2016和美国AOAC方法比较研究指导原则(2012)[12]。我国制定并参照的不同方法之间的验证参考标准为食品微生物检验方法确认技术规范(SN/T 3266—2012)，目前我国正在制定新的食品微生物检验方法验证国家标准(微生物检验方法验证通则)。作者介绍了基于不同原理的检测方法的比较研究概况，简要汇总了不同检测方法之间进行等效性评价的验证方案和具体的评价指标，以及方法验证比较研究面临的机遇与挑战。

1 食品微生物检测方法

1.1 检测方法比较研究现状

方法比较研究是方法验证的重要组成部分，是为了确保可靠的检测方法被正确地应用在检测目标上，从而获得正确、可靠的数据和结论。以 NF Validation (AFNOR 法国标准协会认可)为例，按照ISO 16140原则进行验证的方法进行汇总，根据检测原理不同进行分类，如图 1所示, 可以看出传统的培养法仍然占据主流; 但是新型的分子生物学方法(如各类 PCR 方法)发展迅速, 数量接近于传统培养法。此外，NF Validation方法验证标准中针对的不同病原菌的方法验证研究如图2所示，可以看出，目前以沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的替代方法验证种类和数量最多，一些新开发的检测方法逐步作为替代方法应用于不同食品基质中病原菌的检测。

注：数据统计来自NF Validation网站,截止时间为2020年7月15日。图1 EN ISO 16140—2∶ 2016标准方案进行验证研究的方法分类Fig.1 Methods on validation study performed in accordance with EN ISO 16140—2∶ 2016 standard protocol

注：数据统计来自NF Validation网站,截止时间为2020年7月15日。图2 方法验证在不同食品病原菌中的应用Fig.2 Validation of analytical methods-Application in different microorganism targets

新方法和传统方法的比较研究以及传统方法的更新(修改/改版)一直在不断地进行之中，从而才能加快检测领域的不断进步，满足企业和政府监管部门当下的迫切需求和日益变化的贸易发展需求。但关于不同国家的标准之间的等效性评价及比较性研究较少，这方面相关的研究可以为不同标准间的互认、方法的改进和实践应用提供重要的数据支撑。

1.2 检测方法的比较

1.2.1 基于传统培养法的两种不同检测方法的比较

随着传统标准检测方法的不断应用，即使是普遍应用的标准方法，本身存在的局限性也逐渐被使用者所认知，因此，标准方法的更新和完善也一直在进行中。以克罗诺杆菌属 (原阪崎肠杆菌)的检测方法为例：目前基于传统的生理生化鉴定克罗诺杆菌属的标准方法主要有3种，美国FDA法、ISO法(ISO 22964—2017)和国标方法(GB 4789.40—2016)。2002年，美国食品药品管理局(FDA)发布了克罗诺杆菌属菌株(当时称阪崎肠杆菌)的检测方法。Guillaume-Gentil等[13]随后对该方法进行了修订并发布了一个可替代FDA方法的新方法，主要创新点在于更换了二次选择性增菌液。随后在该方法基础上进一步修订，将选择性培养基VRBG更换为另一种显色培养基，即DFI琼脂。该方法后来成为国际标准微生物委员会(ISO)检测婴幼儿配方粉的技术规范，即ISO/TS 22964∶ 2006 《乳和乳制品-阪崎肠杆菌的检测》。该方法的检测过程相对完善，但是2017年ISO在旧版检测方法(ISO/TS 22964∶ 2006)的基础上更新并发布了新的标准版本(EN ISO 22964∶ 2017)，并将新旧两个版本之间的差异性在欧盟委员会授权(EC Regulation 2073/2005)的基础上进行了方法验证，方法验证的参考标准为ISO 16140(图3)。新旧版本的方法验证项目共有来自9个国家的17家实验室参与[1]。根据两个不同版本的检测方法的检测结果统计分析后发现：新方法EN ISO 22964∶ 2017用于检测克罗诺杆菌属菌株，分别在5种不同的基质中被成功验证，包括不同基质婴儿配方粉、淀粉乳糖和环境样品。

图3 ISO 16140食品微生物检验方法验证基本流程Fig.3 Workflow for validation of food microbiological testing methods

1.2.2 基于分子生物学的快速检测方法与传统方法的比较

沙门氏菌是全球范围内最重要的食源性致病菌之一，针对不同食品基质中沙门氏菌的快速检测流程开发出了多种快速检测方法[14-15]。环介导等温扩增(LAMP)是一种快速的分子生物学检测方法，由于该方法具有检测简单、快速和结果可靠等优点，在国内外的食品企业得到了广泛的应用。2019年，为了确认LAMP方法检测动物食品中沙门氏菌的有效性，将该方法与美国FDA(Food and Drug Administration)的传统标准检测方法BAM Chapter 5 (bacteriological analytical manual)进行了比较研究，该研究在美国和加拿大共计7家实验室参与并共同完成[16]。对两种检测方法结果分析后发现，LAMP方法与BAM方法的检测结果之间无统计学显著差异。此外，有学者将3种分子检测方法(Pathatrix(R) Auto、 VIDAS(R) Easy SLM 和DuPont BAX qPCR)与传统培养法(BAM)进行了比较研究[17]。使用了5种不同的增菌培养基：缓冲蛋白胨水(BPW)、 改良BPW (mBPW)、通用预富集肉汤 (UPB)、BAX(R) MP 培养基和乳糖肉汤(LB)培养基分别对松子仁中的沙门氏菌进行富集培养；而参考方法(BAM)中规定使用的增菌培养基为乳糖肉汤(LB)培养基。研究结果表明：当使用5种预富集培养基增菌培养24 h后, 再接着按照参考方法的标准操作流程分别进行检测，得到的检测结果在统计学上没有显著性差异。基于免疫学原理的VIDAS(R) Easy方法和两种基于qPCR的方法的检测结果具有等效性。

随着新的纳米材料技术和分子检测技术的逐渐成熟，基于抗原抗体的快速检测试剂盒可以提高食品样品中病原菌的检测效率。Decory 等[18]新开发的免疫磁珠检测方法可以检测产志贺毒素的大肠杆菌(STEC), 并且按照AOAC方法验证指南进行了科学有效的验证，证实了其与传统平板培养法在检测食品中STEC具有等效性。

1.2.3 基于物理鉴定技术与传统方法的比较

基于物理学原理的鉴定技术在食源性致病菌的检测方面具有快速、准确和易操作等优点，已被许多国家和检测机构所认可。表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)作为一种快速、可靠、简便的鉴定分型方法，已应用于食源性致病菌的检测之中。Witkowska等[19]利用SERS方法对不同食品基质中的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和克罗诺杆菌属菌株进行了检测，检测结果利用主成分分析(PCA)方法进行分析，表明SERS技术能够有效地将一个属内亲缘关系密切的细菌菌株进行鉴别。SERS方法应用于致病菌鉴定的主要优点在于简化和减少分析时间，从传统的标准方法要求的将近144 h降低到48 h内完成鉴定工作。这项工作的主要目的是将SERS技术引入到3个ISO标准方法(ISO 6579∶ 2002、ISO 11290—1∶ 1996/A1∶ 2004、ISO 22964∶ 2006)中，它可作为一种有效的替代鉴定方法。

多种非官方认可的标准检测方法之间的比较和结合使用，对鉴定结果的准确性有相辅相成的作用，比如使用一代测序技术16 S-ARDRA (Amplified 16 S Ribosomal DNA Restriction Analysis)和MALDI-TOF同时对乳酸菌菌株进行鉴定[20]。两种方法联合使用，可以将80株不同来源的乳酸菌分离菌株在种的水平上进行鉴定，能够将不同来源的乳酸菌分离菌株进行准确有效的鉴定，分辨率高于使用一种方法的分辨率。此外，霉菌的鉴定对普通实验室来讲具有一定的挑战性，传统的鉴定方法存在一定的局限性，需要结合其他方法进行鉴定。Rychert等[21]对丝状真菌分别利用传统生理生化方法Vitek MS v3.0 System(bioMérieux, Marcy l’Etoile, France)、MALDI-TOF 和DNA测序方法对1 519株真菌分离菌株进行了鉴定，并对每个方法的检测结果进行了统计与分析。v3.0可以将91%的菌株准确地鉴定到种的水平，能将2%的菌株鉴定到属的水平，而有6%的菌株v3.0却无法进行准确鉴定。

2 食品中病原微生物检测方法比较原则

国际标准委员会(the International Organization for Standardization, ISO)在2003年组织并制定了替代方法和参考方法验证比较研究的流程和方法等效性评价标准(ISO 16140)，并且该标准方法在2016年经进一步修订并正式生效。ISO明确指出，针对同一目标检测微生物的不同检测方法，如果评判不同检测方法的适用性，需要进行科学系统的评价，因此必须采取科学合理的验证方法进行评价，并推荐使用 ISO 16140—2对两种方法进行科学系统的评价。此外，美国AOAC国际标准方法委员于2012年公布了食品和环境样品中微生物的不同检测方法之间进行等效性评价的指导原则[12]。当前，这两个国际权威机构发布的标准原则为食品微生物不同检测方法之间的比较性研究提供了非常重要的参考依据。

目前，对食品中病原菌的定性或定量检测标准方法绝大多数为传统的培养法，但基于传统法的标准检测方法存在耗时长和检测步骤烦琐等缺点，因而大量新的快速检测方法被研发并逐步得到应用[3-5]。推广和使用任何一种新的快速检测方法的前提条件是提供确凿的数据表明其得出的结果与选择的相应的参考方法得到的检测结果具有等效性。替代方法的特异性、灵敏度和排他性(包容性)需要与已有的参考方法进行比较，实际检测结果必须能够和参考方法具有等效性，同时能够对比较性结果给予合理的解释和说明。参考方法通常选择在国际范围内被大家所认可的、检测结果具有可追溯性的方法，因而通常为传统的培养法。对于食品微生物替代方法的整个验证过程而言，选择标准的参考方法是进行方法比较研究非常重要的先决条件。

2.1 定性方法的比较

2002年，AOAC公布了方法验证比较的指导原则和要求。此后，AOAC对该方法验证比较指导原则在2012年进行了更新，其中，定性方法的方案设计和数据分析都是基于检出可能性(probability of detection, POD)模型进行计算。它是一种用于定性方法验证的统计模型，统一了定量和定性方法验证之间的统计概念和参数。利用POD模型可以进行两种检测方法在单实验室研究(重复性)和多实验室协同研究(再现性)的等效性评价[22-23]。

针对某一相同基质类型的食品中两种检测方法进行定性比较研究，两种方法通常均用于食品中某一特定致病菌的检测。为了比较两种不同的定性检测方法的检测性能(灵敏度和特异性)之间的差异，通常参照ISO 16140的要求进行一系列比较实验和结果比较分析[1]。或者依据AOAC方法比较验证指导原则进行科学的系统性比较研究[12]。目前，两种方法验证比较的流程、基本要求和数据分析等均具有相似性。

2.2 定量方法的比较

对食品样品中某一重要指标微生物进行定量检测也是非常必要的，例如婴幼儿配方粉中双歧杆菌含量的测定[24]。由于双歧杆菌的含量对于其定殖婴幼儿肠道起着一定的作用，因此为了比较两种不同的定量检测方法的检测性能(相对准确度和精确度)之间的差异，通常可以参照ISO 16140—2中的定量检测方法比较研究要求进行一系列比较实验和结果分析，或者依据AOAC 方法比较指导原则进行科学、系统性的方法验证比较研究。

ISO 16140∶ 2003中对两种方法等效性的最终判断时提出，两种方法的等效性判断主要基于一套零假设检验，旨在说明替代方法的估计参数与参考方法无显著性差异，但是该判定标准存在不足之处[25-26]。因此, Hubert等[27-30]对定量方法的数据统计和分析进行了研究和修改，提出了新的数据统计和判断方法。在此研究基础上，ISO 16140在2016年经修订后重新对外公布生效，并对定量方法比较研究的方案和数据处理及分析方法进行了更新，包括单实验室研究(重复性)和多实验室协同研究(再现性)的等效性评价。目前，AOAC 方法比较指导原则与ISO 16140∶ 2016两种微生物定量检测方法验证比较研究在数据统计分析上具有相似性。

3 分析与讨论

3．1 标准方法比较的意义和作用

以往的方法比较研究结果表明，基于传统培养法的不同标准检测方法在检测性能参数(灵敏度和特异性)上存在一定的差别[31]。基于ISO 17025∶ 2017的规定，排除人为和设备等造成系统性偏差的因素之外，影响检测性能的主要因素有初始的样品量、样品基质、选择性培养基、培养温度和初始污染量等因素。因此，针对相同的食品种类，使用不同的传统标准检测方法，有可能会得到不同的检测结果。以婴幼儿配方粉中的克罗诺杆菌属传统检测方法为例：中国在2008年制定并公布了婴幼儿配方粉中的阪崎肠杆菌检测方法(GB 4789.40—2008), 并于2010年和2016年经过两次修订，形成了目前最新的国标方法(GB 4789.40—2016)。由于GB 4789.40—2016与ISO 22964—2017在取样量、选择性培养基、选择性培养过程中的培养温度以及后续的鉴定步骤均不相同，因此开展两种基于传统培养法的标准检测方法的比较研究具有十分重要的科学意义。

3.2 方法比较的程序

尽管传统的培养法依旧为食源性致病菌检测的“金标准”[32]，但是根据新技术和新原理开发出来的针对食源性致病菌的检测方法具有自身独特的优势，例如高灵敏度、检测周期短和操作简便等优点，可以应用到评估原料和快速放行成品以及监测生产过程的微生物状态中，可以帮助食品企业提高放行速度。然而如果没有通过方法等效性验证就直接使用这些方法，可能导致错检和漏检，对产品质量和食品安全都存在巨大隐患。因此，新开发出来的检测方法必须经过科学的系统的方法验证程序[33]，通过等效性确认后才可以被认可为替代方法。可以根据方法的适用范围和检测能力(定性或定量)选择已经公布的标准方法作为参考方法[34]，然后选择按照ISO 16140—2(2016)或AOAC方法验证指导原则(2012)中的要求进行科学规范的方法验证，验证报告中的数据应真实客观，通过数据收集和统计学分析可以得出两种检测方法在灵敏度、重复性和重现性上是否具有一致性的结果，从而来判定两种方法在检测某种食品类型或类别中的病原菌是否具有等效性。基于ISO 16140∶ 2003版本(旧版)中的方法比较程序，已有超过100种替代方法得到了验证。有了科学的评判原则，新的方法生成的性能数据还为潜在的终端用户在采用替代方法时根据评价结果做出明智的选择。同时，两种方法验证数据也可以作为一个独立组织认证与评价一种新的替代方法有效性的重要依据。

3.3 机遇与挑战

食品中特定病原微生物的传统检测方法由于检测周期长、费时耗力，不断受到新的检测方法的巨大的冲击和挑战。基于分子生物学技术、免疫技术、纳米材料以及下一代测序技术(NGS)等各种新技术原理基础之上开发出一系列新的微生物快速检测方法[35-40]，并且有些检测方法在食品质量与安全领域已经逐渐成为非常重要的替代检测方法，如基于质谱原理开发的检测方法[41]。另外，食品工业对于食品微生物的检测方法的要求也是越来越高，包括灵敏度、特异性、检测时间、检测结果准确性等性能参数。截止目前，针对食品中同一病原菌的检测，已开发出多种新的检测方法，每种方法各有自己的优缺点，因此十分有必要对不同的检测方法进行比较性研究。在设计方法验证方案时，首先需要确定正确的参考方法，然后选择尽可能多的食品基质类别，检测尽可能多的样品数量。如果没有自然污染样品，如何制备和保持低污染水平的人工污染样品，同时保证病原菌的稳定性和均一性，获得大量数据后如何进行统计分析等，这些因素均对开展方法比较研究提出了更高的要求和挑战。针对相同食品中的同一病原菌而言，今后在选择微生物替代检测方法时仍然要慎重考虑，建议选择的依据如下：(1)是否按照大家公认的标准方法(例如ISO16140或AOAC指导原则)与传统的标准检测方法进行过科学的验证和等效性评价；(2)适合的检测基质类型；(3)所需要的设备和检测成本；(4)灵敏度和特异性；(5)检测周期；(6)局限性。总之，企业在应用可供选择的替代检测方法时，需要按照以上依据综合评判，要了解没有通过一致性评价的方法应用的风险，才能选择合理的测试方法。当这些新的替代方法经过方法验证标准的要求并与参考方法具有等效性的检测结果评价之后，即可以作为企业内部标准或者行业标准、团体标准。另外，在其他领域的新方法开发与实际应用中同样需要对新开发的检测方法进行比较研究，例如临床样本的诊断方法[42]以及植物病理学的诊断方法[43]等领域均需要进行方法验证研究，因而方法验证标准可在多领域推广和应用。

4 结论与展望

我国食品微生物检测方法的强制性执行标准为国家标准，但对于食品企业而言，由于食品基质类型多样，国家标准无法满足在实际生产过程中的真正需求，迫切需要一些新的替代方法能够作为国家标准的一种有效补充。我国也正在制定微生物检验方法验证通则(方法验证标准)。两种检测方法进行等效性评价，必须要按照科学的比较程序进行实施。当前国际上广泛认可的方法比较参考标准为ISO 16140—2016和美国AOAC 官方指导原则(2012)。两种程序的流程、基本要求和数据分析等均具有相似性，但也存在差异，均为国际认可的官方分析方法。

鉴于国际食品贸易往来的加剧，针对相同食品中同一病原菌的检测方法之间的等效性评价就显得尤为必要。除了对新开发的快速检测方法进行比较研究外，同时也需要对基于传统培养法的具有不同检测流程的两种标准检测方法进行比较研究；按照ISO 16140—2016或美国AOAC 官方指导原则(2012)通过对两种传统检测方法的检测性能参数(灵敏度和特异性等)进行比较性研究还是具有非常重要的应用价值。方法等效性评价结果将为两种方法今后在不同国家或区域之间的相互等同认可提供重要的数据支撑和科学依据。