羟基化多壁碳纳米管电化学传感器制备以及应用研究

李军涛，王 艳，李向前，陈素霞

(石家庄市第八医院，河北 石家庄 050000)

抑郁症是现代较为常见的心理障碍疾病，患者长时间处于情绪低落、运动抑制的状态，对身体健康造成极大的影响，严重者甚至危及生命。抗抑郁药是帮助缓解抑制症的有效方法，目前常见的抗抑郁药有氟伏沙明、舍曲林、氟西汀、帕罗西汀。这些药物能够有效缓解抑郁症患者的症状，但是对我们体内代谢酶CYP2D6有一定的抑制作用。研究抗抑郁药的抑制性能对指导临床用药有至关重要的作用，广大学者进行了很多研究。有学者提出用高效液相色谱法分析药物成分的抑制作用，但色谱法存在操作复杂、检测时间长，仪器设备昂贵的问题[1]；用荧光光谱法对药物成分进行抑制分析，改善了色谱法检测时间长、操作复杂的问题，但设备昂贵的问题还是没有得到很好的解决[2]。而电化学酶传感器具有操作简单、仪器简单，选择性好等优点，在2020年对近 5 年生物传感器在酶抑制剂类药物检测中的应用进展进行综述，证实电化学传感器能够有效检测酶抑制活性[3]；但是电化学传感器的具体应用还存在问题。本文在文献[3]的研究基础上，针对传统酶体外检测光谱法、色谱法设备昂贵的问题，用硝酸和硫酸混合溶液对多壁碳纳米管进行羧基化，然后以此为基体制备Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 传感器，并探讨不同抗抑郁药物对CYP2D6 的抑制作用,从而为临床抗抑郁药的指导用药提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

本试验主要材料：硝酸(佛山市华希盛化工有限公司)、硫酸(山东辰达化工有限公司)、氢溴酸右美沙芬(北京汇智泰康医药技术有限公司)、舍曲林(辉瑞制药有限公司)、帕罗西汀(浙江华海药业股份有限公司)、氟西汀(武汉多普乐生物医药有限公司)、氟伏沙明(武汉欣欣佳丽生物科技有限公司)：均为AR；多壁碳纳米管(湖北科沃德化工有限公司，>95%)；CYP2D6(上海恒远生物科技有限公司，PMO)。

本试验主要设备：ADS-1720Q超声波清洗机 (佛山市安迪信超声清洗设备有限公司)；DZF-6090真空干燥箱(上海仪天科学仪器有限公司)；LIDA-20傅里叶变换红外光谱仪(天津恒创立达科技发展有限公司)；SS-150冷场扫描电子显微镜(深圳市善时仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1c-MWCNTs的制备

(1)将H2SO4与HNO3按照体积比3∶1混合，取10 mL混合溶液，将10 mg多壁碳纳米管分散于混合溶液中；

(2)将混合溶液置于ADS-1720Q型超声波清洗机中进行超声分散，超声时间为30 min。取出混合溶液后，在室温条件下充分搅拌，搅拌时间为4 h；

(3)对混合溶液进行抽滤，并用去离子水冲洗抽滤产物4次。然后将产物置于DZF-6090型真空干燥箱内充分干燥，干燥温度和时间分别为60 ℃和12 h，得到羧基化多壁碳纳米管；

(4)在4 mL去离子水中融入4 mg羧基化多壁碳纳米管；然后置于ADS-1720Q型超声波清洗机中超声分散，超声时间为30 min。

1.2.2Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 传感器的组装

(1)依次在1.0、0.3和0.05 μm的α-氧化铝粉中对玻碳电极进行打磨；然后依次在体积比为1∶1的硝酸溶液、乙醇额溶液和去离子水中进行超声清洗，清洗时间为3 min。捞出后置于室温通风环境中干燥；

(2)将玻碳电极置于浓度为1 mol/L的H2SO4溶液中，然后采用CV法对玻碳电极进行活化[4]；CV法参数如表1所示 ；

表1 CV法参数Tab.1 CV method parameters

(3)活化后在玻碳电极上滴涂5 μL羧基化多壁碳纳米管溶液，然后置于室温通风环境中干燥。将干燥后电极置于100 mmol/L的EDC/NHS 溶液中浸泡1 h，之后在电极上滴涂5 μL的CYP2D6 酶溶液，继续干燥，干燥温度和时间分别为4 ℃和12 h；

(4)用pH值为7.4的浓度为0.1 mol/L的PBS冲洗掉玻碳电极中未固化的酶；然后在电极上滴加5 μL质量分数为0.5%的Nafion 溶液，继续置于温度为4 ℃环境下干燥保存[5]。

1.2.3Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 传感器的电化学测量条件

本试验采用三电极体系，其中参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂丝电极。传感器直接电化学行为由CV法测得，循环伏安扫描电位和扫描速度分别为-0.8～0.1 V、50 mV/s[6]。对抗抑郁药的测定则是采用DPV法，以含有20 μmol/L、pH值为7.4的右美沙芬作为测试底液，测试温度为20 ℃。

抗抑郁药抑制率(Inhibition)表达式[7]：

拟制率=(ip0-ipt)/ip0×100%

(1)

式中：ip0为抗抑郁药抑制前的电流信号；ipt为抗抑郁药抑制后的电流信号。

1.3 性能表征

1.3.1红外光谱分析

用LIDA-20型傅里叶变换红外光谱仪对c-MWCNTs进行扫描。

1.3.2扫描电镜分析

用导电胶将c-MWCNTs固定在样品台上，然后放入SS-150型冷场扫描电子显微镜中进行扫描。

2 结果与讨论

2.1 c-MWCNTs表征

2.1.1c-MWCNTs 的红外表征

图1为c-MWCNTs 的红外谱图。

图1 c-MWCNTs的红外谱图Fig.1 Infrared spectrum of c-MWCNTs

2.1.2扫描电镜表征

图2为c-MWCNTs的扫描电镜图，其中图2(a)为整体形貌；图2(b)为局部放大图。由图2可知， c-MWCNTs较长，管径分布较为均匀，且外壁光滑。

图2 c-MWCNTs的扫描电镜图Fig.2 SEM of c-MWCNTs

2.2 Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 电化学行为

2.2.1电化学交流阻抗

图3为玻碳电极交流阻抗谱图；测试底液为0.1 mol/L的KCl和5 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-混合溶液。

a-玻碳电极；b-c-MWCNTs/玻碳电极；c-CYP2D6/c-MWCNTs/玻碳电极图3 交流阻抗谱图Fig.3 AC impedance spectrum

由图3可知，未经修饰的玻碳电极电子转移阻抗大概为590 Ω。在玻碳电极修饰了羧基化多壁碳纳米管后，其电子转移阻抗下降比较明显，这证明了羧基化多壁碳纳米管具有良好的导电性，对电极表面的电子转移有较好的促进作用[9]。将CYP2D6固定在修饰电极后，电子转移的阻抗出现小幅度增加；这是因为CYP2D6为电的不良导体，玻碳电极固定了CYP2D6后，离子难以从溶液扩散至电极表面，使得阻抗变大。

2.2.2电极修饰过程直接化学

图4为循环伏安曲线；测试底液是浓度为0.1 mol/L、pH值为7.4的PBS溶液;扫描速度为50 mV/s。

a-玻碳电极；b-c-MWCNTs/玻碳电极；c-CYP2D6/c-MWCNTs/玻碳电极

由图4可知，未经CYP2D6修饰的玻碳电极和多壁碳纳米管修饰电极上都没有电流峰存在；而经过CYP2D6修饰后，循环伏安曲线有一对比较明显的氧化还原峰出现[10-13]。这证明经过CYP2D6的修饰，玻碳电极上发生一定的电子转移，进而表明在玻碳电极上成功固定了CYP2D6。

2.3 Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 在探针底物中的电催化

图5为Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE传感器在不同浓度的右美沙芬中，用DPV法测定的还原峰电流。

图5 Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE传感器在不同浓度右美沙芬中的还原峰电流Fig.5 Reduction peak current ofNafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE sensorin different concentrations of dextromethorphan

由图5可知，随右美沙芬浓度的增加，还原峰电流也持续增加；这证明本文制备的传感器具备了CYP2D6对抑郁药的代谢能力。

2.4 传感器优化

图6为DPV法测定Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE传感器在含有10 μmol/L帕罗西汀，pH值为7.4、浓度为0.1 mol/L的PBS溶液中的抑制前后酶的生物活性，其中图6(a)为还原峰电流信号随时间变化图；图6(b)为抑制率随时间变化图。

图6 抑制前后酶的生物活性Fig.6 Biological activity of enzyme before and after inhibition

由图6可知，抑制前期，酶抑制率快速增加。当抑制时间达到36 min时，酶抑制率高达70.3%；当继续增加抑制时间，抑制率增加趋势变缓，因此，本试验选择的抑制时间为36 min。

2.5 抗抑郁药对CYP2D2酶活性的抑制

表2为几种抗抑郁药的抑制效果。其中IC50是抑制率为50%时抗抑郁药的浓度，IC50值大小表示该抑郁药对CYP2D6的抑制能力。IC50值越小，则抗抑郁药对CYP2D6抑制能力越强；当IC50比1 μmol/L小时，则该抑制剂为强抑制剂；当IC50位于1～10 μmol/L时，则该抑制剂为中抑制剂；当IC50位于10～50 μmol/L时，则该抑制剂为弱抑制剂；当IC50大于50 μmol/L时，该抑制剂为较弱抑制剂，此时可认定该抑制剂对CYP2D6没有抑制[14-17]。

表2 几种抗抑郁药的抑制效果Tab.2 Inhibitory effect of several antidepressants μmol/L

由表2可知，几种抗抑郁药对CYP2D6的抑制能力从小到大依次为：氟伏沙明(IC50 22.8 μmol/L)、舍曲林(IC50 10 μmol/L)、氟西汀(IC50 3.9 μmol/L)、帕罗西汀(IC50 1.8 μmol/L)，这证明了舍曲林和氟伏沙明为弱抑制剂；帕罗西汀和氟西汀为中抑制剂。

2.6 传感器的稳定性和重现性

测定Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE传感器在含有20 μmol/L右美沙芬，浓度为0.1 mol/L、pH值为7.4的PBS溶液中的还原峰电流值。10次试验结果标准偏差为4.3%，这证明了本文制备的传感器具有比较好的重现性。将制备好的电极置于温度4 ℃条件下进行保存，7 d后观察信号损失为4.5%；这证明该传感器具有较好的稳定性。

3 电化学传感器的应用

基于以上传感器对不同抗抑郁治疗药物抑制作用的分析，以对CYP2D6抑制最强的帕罗西汀药物为例，结合于2020年1月～2021年4月收治的抑郁患者102例作为研究对象，将102例患者分为观察组和对照组，其中对照组给予帕罗西汀，每早1次；观察组给予帕罗西汀+失眠认知行为指导。由此对比患者在治疗前及治疗1、3和6个月的PSQ-T评分[18-20]；具体结果如图7所示。

图7 治疗前后的PSQ-T评分对比Fig.7 Comparison of the PSQ-T scores beforeand after treatment

由图7可知，与治疗前比较，2组患者治疗1、3和6个月后PSQ-T评分显著降低(P<0.05)；治疗1个月联用PSQ-T评分显著低于单用组(P<0.05)。在采用帕罗西汀+失眠认知行为指导的观察组的PSQ-T得分低于对照组，说明采用这种治疗方式可有效治疗抑郁并有失眠的患者。

4 结语

本试验以体积比为3∶1的H2SO4与HNO3混合溶液制备的以c-MWCNTs为基底制备Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 传感器。通过对 c-MWCNTs微结构和Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE 传感器电化学行为进行表征，得到的具体结论为：

(1)经过体积比为3∶1的H2SO4与HNO3混合溶液作用，成功在多壁碳纳米管上引入羧基。且制备的c-MWCNTs管径均匀，外壁较光滑；

(2)玻碳电极表面成功固定CYP2D6后，离子难以从溶液扩散至电极表面，传感器阻抗变大；

(3)DPV法测定的还原峰电流证明Nafion/CYP2D6/c-MWCNTs/GCE传感器具备CYP2D6对抑郁药的代谢能力；

(4)DPV法对抑制前后酶的生物活性进行测定，在抑制时间为36 min时，酶抑制率为70.3%。而后随时间增加，酶抑制增长速度变慢，确定抑制时间为36 min；

(5)几种抗抑郁药中，舍曲林和氟伏沙明为弱抑制剂，帕罗西汀和氟西汀为中抑制剂。对CYP2D6的抑制能力大小依次为：氟伏沙明(IC50 22.8 μmol/L)、舍曲林(IC50 10 μmol/L)、氟西汀(IC50 3.9 μmol/L)、帕罗西汀(IC50 1.8 μmol/L)；

(6)传感器在4 ℃环境下保存7 d，信号损失仅为4.5%；10次还原峰电流值标准偏差仅为4.3%，证明本试验制备的传感器具有较好的重现性和稳定性。