海马内注射鸢尾素缓解小鼠抑郁样行为

李 晶，黄炳轩，许 琪*

(1 中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 生物化学与分子生物学系国家医学分子生物学重点实验室，北京 100005；2.北京市第一六六中学，北京 100006)

抑郁症 (depression) 是最常见的心境障碍，以显著而持久的情绪低落为主要临床特征。近年来，抑郁症的发病率及患者自杀率呈现显著增长态势[1]，诸多生理及心理因素均可促使其发生，并且与多种慢性疾病存在共病的现象[2]。调查显示，体育锻炼可以减轻抑郁和焦虑症状。一项包含了 48 207名受试者的荟萃分析显示，体育锻炼可以显著降低抑郁水平[3]。研究人员还提出了一些机制模型用于解释运动如何缓解抑郁症状，包括改变血清素系统[4]、影响下丘脑-垂体-肾上腺轴[5]等。

近些年，有研究发现鸢尾素 (irisin) 是一种在运动后高表达的激素[6]。鸢尾素是一种跨膜前体蛋白激素，从纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5, FNDC5) 中经过剪切修饰而得到，高表达于肌肉和脂肪组织中，主要发挥调节葡萄糖稳态的作用[7]。外周循环系统中的鸢尾素可以穿过血脑屏障，进入脑脊液和脑实质中[8]。有研究表明鸢尾素对脑疾病有积极作用，能够挽救突触连接衰竭及损伤，在阿尔茨海默病疾病模型中提供神经保护效果。综上所述，鉴于鸢尾素在运动后大量分泌且具有神经保护效果，我们推测其可能和体育运动的抗抑郁机制有关。本研究探讨了海马内注射鸢尾素对小鼠的抗抑郁效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：重组鸢尾素 (Sigma-Aldrich公司)；水合氯醛 (上海生工公司)；过氧化氢 (上海生工公司)；磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer saline, PBS) (中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。

1.1.2 小鼠：8 周龄雄性 C57BL/6小鼠63只 (维通利华公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验设计流程及分组情况：在研究 OSFS 模型致抑郁作用的实验中，将 25 只小鼠随机分为两组，分别是：健康对照组(healthy)12只，不进行任何处理；开放空间强迫游泳 (open-space forced swim, OSFS)模型组13只，进行OSFS模型构建。在研究脑内注射鸢尾素的实验中，另取38只小鼠随机分为4组，分别是：1)健康无压力且注射 PBS(OSFS-、irisin-) 7 只；2)无压力且注射鸢尾素 (OSFS-、irisin+) 7 只；3)OSFS模型且注射 PBS (OSFS+、irisin-)12 只；4)OSFS模型且注射鸢尾素(OSFS+、irisin+)12只。小鼠被笼养于12 h∶12 h 光-暗循环 (光照07∶00至19∶00)、温度 22～24 ℃、湿度 40%～60% 的环境中，自由饮食。所有成年动物均按照中国医学科学院及北京协和医学院机构审查委员会批准的条例进行饲养和处理，并在北京实验动物管理办公室《实验动物护理和使用指南》的规定范围内进行。

1.2.2 OSFS动物模型：本研究对OSFS急性抑郁模型[9]进行了微小的改动：使用28 cm×17 cm×16 cm长方形塑料容器，向其内添加温水，高度约11 cm，水温在 32～34 ℃。将小鼠置于其中游泳， 计时15 min后取出，每天1次，持续4 d。

1.2.3 脑立体定位注射：使用 5% 水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，以体质量为依据计算水合氯醛的用药量(0.1 mL/10 g)。待小鼠完全麻醉后, 将小鼠固定到立体定位仪上，剃除小鼠头部毛发，用解剖剪剪开小鼠头皮，用 3% 过氧化氢去除颅骨上方的结缔组织，暴露颅骨。以Bregma为原点，用手持式电动微型颅钻在海马处[前后(AP)=2.0 mm, 左右(ML)=±1.8 mm]钻孔，利用微量注射器在1 min 内将0.1 μL重组鸢尾素(77 pmol)或PBS(作为对照)注射到海马内[背腹(DV)=2.0 mm]。注射后留针约2 min 以防止注射液倒流，最后缓慢拔出注射器。完成两侧海马注射后缝合小鼠头部皮肤，并将小鼠放置于37 ℃热板上缓慢恢复30 min后放回笼中。

1.2.4 强迫游泳实验 (forced swim test, FST)：参照前人方案[10]进行。在一个 3 L 的玻璃烧杯 (直径 10 cm；高度 20 cm) 中加入 (24±1)℃自来水至15 cm高。将小鼠单独放置在水中游泳6 min，同时进行视频记录，后 4 min 纳入分析，进行双盲评估。不动时间定义为小鼠四肢都不动、或偶有后肢踩水以保持悬浮状态所持续的时间。

1.2.5 悬尾实验(tail suspension test, TST)[11]：悬尾实验使用 Noldus 公司 EthoVision XT 3.1 实验系统进行数据采集，检测开始前 1 h，将小鼠转移到检测环境中适应。测试前用胶带连接鼠尾及仪器检测的金属钩，使小鼠倒挂于检测箱内，身体悬空不能触碰到左右两侧及底侧壁。测试持续 6 min，阈值设定为 2.5～60，低于2.5的时间被纳入不动时间，全部6 min都纳入分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 开放空间游泳模型可诱导绝望样抑郁行为

本研究首先建立了一种 OSFS 急性小鼠抑郁症模型 (图1A)。在强迫游泳实验中，OSFS 模型组小鼠的不动时间显著长于野生小鼠 (P<0.01) (图1B)；在悬尾实验中，模型组小鼠的不动时间也显著提升 (P<0.05) (图1C)。综上，OSFS 可诱导小鼠产生绝望样抑郁行为，模型构建成功。

2.2 双侧海马注射鸢尾素能够缓解 OSFS 所致的抑郁样行为

为探究鸢尾素对抑郁状态的影响，本研究利用构建好的 OSFS 抑郁模型小鼠，通过脑内海马注射的方式给予鸢尾素，并通过行为学手段检测其抗抑郁效果(图2A)。在强迫游泳实验中，健康小鼠在无压力情况下(OSFS-) 注射鸢尾素未显著改变小鼠的不动时间。而与之相比，抑郁模型 (OSFS+, irisin-) 组小鼠不动时间显著提升 (P<0.01)，出现抑郁样行为；注射鸢尾素 (OSFS+, irisin+) 可以显著降低小鼠的不动时间 (P<0.001)，与健康小鼠无显著区别 (图2B)。在悬尾实验中，注射鸢尾素对健康小鼠 (OSFS-) 同样没有显著影响，而对抑郁小鼠 (OSFS+) 的不动时间显著降低 (P<0.05) (图2C)。综上说明鸢尾素能够缓解由 OSFS 抑郁模型所致的绝望样行为。

3 讨论

鸢尾素最初在体育运动[6]或寒冷环境[12]的刺激下被发现高表达于血清中，作用于白色脂肪细胞并促进其棕色样发育，以增加能量消耗，提升产热效率，起到改善肥胖状态与调节葡萄糖稳态的作用；后来研究发现运动或寒冷刺激产生肌肉震颤[13]，促使鸢尾素大量分泌。有研究发现鸢尾素在神经系统中起到重要作用。鸢尾素在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 患者及小鼠模型中均有所降低，并且人为提升外周鸢尾素的水平可以有效改善AD相关的突触丢失、突触可塑性及记忆损伤，初步揭示了鸢尾素可能发挥显著的神经保护作用[7]。

有研究报道鸢尾素在慢性不可预见性应激(chronic unpredictable stress, CUS)模型的大鼠中具有抗抑郁效果[14]。CUS模型的建模周期长达4～6周，小鼠罹患压力大，更好地模拟了重度抑郁症的行为特征。本文是应用小鼠的急性应激抑郁模型(OSFS)证实鸢尾素的抗抑郁疗效的研究，为鸢尾素抗抑郁这一结论提供了更坚实的证据。OSFS模型周期短，压力更小，很好地模拟了人类在一般压力下的抑郁情绪，有望在后续对抑郁的相关研究中发挥作用。

目前关于鸢尾素调节神经系统的确切生理机制仍然不清楚。许多研究发现脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 及其相关通路与鸢尾素有密切的联系[5, 15]，也有研究报道鸢尾素通过促进神经发生等来改善认知功能及精神状态[16-17]。鸢尾素在骨细胞及脂肪细胞上的信号传导可能经由与integrin αV 受体的相互作用所介导[18]，然而其在神经细胞上的受体或信号传递方式仍未明确。上述方面的深入研究对我们更深刻地理解鸢尾素复杂的生理效应具有重要意义。

综上所述，中枢鸢尾素水平的人为提升能够有效挽救抑郁模型小鼠的行为绝望，初步证实了鸢尾素具有对抑郁行为的改善效果。前期报道证实了体育活动[19]及日常锻炼的生活方式[20]可以提高鸢尾素在脑组织中的表达。本研究进一步揭示了鸢尾素可能介导了体育运动对精神状态的积极调节作用，为临床中对抑郁症患者恰当使用运动疗法提供了初步的动物行为学实验证据，并展示出鸢尾素开发成为抗抑郁药物的前景和应用价值。