抑制小凹蛋白减轻大鼠脑缺血/再灌注诱导的神经功能损伤

陈宁宁，应新旺，谢庆凤*

(1.浙江中医药大学附属温州市中医院 康复科，浙江 温州 325000;2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 康复医学中心，浙江 温州 325000)

卒中是造成全球死亡率和残疾负担增加的重要因素[1]。缺血性卒中是指脑的供血动脉狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死，是最常见的卒中类型[2-3]。胶质细胞介导了缺血性卒中损伤后的炎性反应。缺血性卒中后，星形胶质细胞的标志物GFAP以及小胶质细胞的标志物Iba1表达会上调[4]。有研究表明，抑制胶质细胞的激活能发挥显著的神经保护作用[5]。小凹蛋白1(caveolin1，Cav1) 是一种完整的膜蛋白，是细胞膜上小窝的主要成分，参与多种细胞功能，如内吞作用、胆固醇稳态、信号传导和机械保护等[6]。Cav1的磷酸化修饰是Cav1发挥作用的重要环节，有研究表明p-Cav1是早期炎性反应的重要指标[7]。本研究旨在通过使用Cav1磷酸化抑制剂4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑(4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d] pyrimidine, PP2)探讨p-Cav1在脑缺血/再灌注后神经功能损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物： 45只SPF级2～3月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠，质量220～250 g，购自北京维通利华实验动物有限公司[SCXK(京)2012-0001]。本实验已通过温州医科大学动物保护和使用委员会同意，符合实验动物伦理学要求。

1.1.2 药品与试剂：抑制剂PP2(Cosmo Bio公司)；p-Cav1 (Y14)抗体(Affinity公司)；GFAP、Iba1和Tubulin抗体(Abcam生物技术有限公司)；Nissl染色试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)；Tunel染色试剂盒(Roche生物技术公司)；山羊抗兔/山羊抗小鼠二抗(上海翌圣生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理： 将大鼠随机分为假手术组(sham)、模型组(model)和抑制剂组(PP2)。每组各15只。模型组用改良 Belayev 法建立大鼠 MCAO 模型。抑制剂组(PP2)在缺血30 min后腹腔注射抑制剂PP2 (1.0 mg/kg)[8-9]，之后每隔24 h注射1次，共注射3次。

1.2.2 mNSS评分检测大鼠神经行为学： 对脑缺血/再灌注3 d后的大鼠进行运动试验、感觉试验、平衡木试验和反射等方面进行神经行为学评分，分数越高，代表神经系统功能损害越严重。

1.2.3 Nissl染色和TUNEL染色检测组织形态: 根据试剂盒的操作流程分别检测各组间的尼氏小体以及细胞凋亡数量，然后在显微镜下观察拍照，进行数据统计分析。

1.2.4 免疫荧光染色定位胶质细胞: 将石蜡切片经过脱蜡漂洗之后，用10%山羊血清在室温下封闭2 h，切片滴加兔抗大鼠 p-Cav1抗体(1∶100)、兔抗大鼠Iba1抗体(1∶100)/小鼠抗大鼠GFAP抗体混合液(1∶100)于湿盒中孵育(4 ℃)16～20 h，在阴性对照中使用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 代替一抗，其余步骤相同。复温漂洗后滴加二抗(混合液孵育2 h(避光环境)，漂洗后10% DAPI染核5 min(避光环境)，漂洗后擦干切片滴加防荧光猝灭剂封片，在荧光显微镜下观察拍照。

1.2.5 Western blot 检测p-Cav1、GFAP、Iba1蛋白：用BCA法测蛋白，以 60 μg蛋白量为标准，以15 μL为上样量进行电泳。用300 mA恒流电转膜约90 min，结束后先将膜置于1×TBS液中平衡5 min，再置入 5%脱脂牛奶中封闭 2 h。TBST漂洗3次×5 min；加入一抗4 ℃过夜。TBST漂洗后加入HRP-抗兔/鼠IgG(1∶2 000)室温孵育1 h。ECL显影后用Image J软件对条带吸光度值进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 抑制p-Cav1对神经功能和脑梗死体积的影响

与假手术组相比，模型组的大鼠神经行为学评分明显增高(P<0.05)；与模型组相比，抑制剂组大鼠神经功能评分明显下降(P<0.05)。TTC染色结果显示模型组梗死灶体积最大，而抑制剂组较模型组明显下降(P<0.05)(图1)。

A.TTC staining; B.statistics of neurobehavioral score; C.cerebral infarction volume statistics; *P<0.05 compared with sham group, #P<0.05 compared with model group

2.2 抑制p-Cav1对梗死灶周围组织的影响

Nissl染色结果显示假手术组中尼氏体大而数量多，模型组中则观察到尼氏体数量明显减少(P<0.05)，抑制剂组中尼氏体数量较模型组增多(P<0.05)(图2A,C)。TUNEL染色结果显示与假手术组相比，模型组梗死灶周围组织中细胞凋亡数量明显增加(P<0.05)，抑制剂组中凋亡细胞较模型组显著减少(P<0.05)(图2B,D)。

A.Nissl staining, scale bar=50 μm; B.Tunel staining, scale bar=50 μm; C.statistics of number of Nissl bodies; D.statistics of number of apoptotic cells;*P<0.05 compared with sham group, #P<0.05 compared with model group

2.3 脑缺血/再灌注损伤对梗死灶周围组织中p-Cav1蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型组中p-Cav1表达明显上调(P<0.05)；与模型组相比，抑制剂组p-Cav1表达显著下调(P<0.05)(图3)。

A.expression of p-Cav1 protein; B.statistics of p-Cav1 relative expression; C.p-Cav1 immunofluorescence staining around cerebral infarction,scale bar=50 μm; *P<0.05 compared with sham group, #P<0.05 compared with model group

2.4 抑制p-Cav1对GFAP和Iba1蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型组中GFAP和Iba1表达上调，星形胶质细胞与小胶质细胞胞体变大，突起增多，激活的星形胶质细胞和小胶质细胞的距离缩小，相互作用增多(P<0.05)。与模型组相比，抑制剂组中GFAP和Iba1的表达明显下降，趋向于假手术组的细胞形态，并且星形胶质细胞和小胶质细胞的相互作用较少(P<0.05)(图4)。

A.expression of GFAP and Iba1 protein; B.statistics of Iba1 relative expression; C.statistics of GFAP relative expression; D.GFAP/Iba1 immunofluorescence co-staining; E.enlarged result diagram, scale bar=50 μm；*P<0.05 compared with sham group, #P<0.05 compared with model group

3 讨论

脑缺血/再灌注损伤后，常伴随神经炎性反应的发生，主要表现为神经胶质细胞的激活增生及相关炎性细胞因子的表达[10]。以往研究表明，在中枢神经系统损伤早期，神经胶质细胞迅速激活增殖，释放炎性介质诱导炎性反应，将新病灶局限化，并通过胶质源性神经营养因子促使神经元修复；如果损伤刺激未能适当控制或持续存在，将进一步加重炎性反应，导致神经元损伤，这就是神经胶质细胞在中枢神经系统疾病中的双重作用[11]。最新研究表明，脑缺血再灌注3 d后，神经胶质细胞明显激活并伴随着神经功能受损加重[12]。在本实验研究中，脑缺血再灌注后大鼠的脑组织中GFAP和Iba1表达明显增加，伴随着凋亡细胞数量增多。这表明在脑缺血/再灌注损伤3 d后神经胶质细胞激活会诱发神经功能缺损。

星形胶质细胞和小胶质细胞是介导中枢神经系统炎性反应最重要的两类胶质细胞，它们在一定的病理条件下表型会发生改变，分泌相应促炎因子[5]。有证据显示星形胶质细胞和小胶质细胞之间的相互作用在神经炎性反应中发挥着至关重要的作用[13]。一方面，小胶质细胞可以促使星形胶质细胞向A1型转化，产生神经毒性作用[5]；另一方面，星形胶质细胞也可以刺激小胶质细胞释放更多的促炎因子，介导神经毒性反应[14]。本研究结果证实了在脑缺血/再灌注后神经胶质细胞间的相互作用能诱导神经功能缺损。

研究表明 p-Cav1是早期炎性反应的重要指标[7]。本研究结果显示使用p-Cav1抑制剂PP2可以介导脑缺血/再灌注后梗死灶周围组织中神经胶质细胞激活及交互作用，从而发挥神经保护作用。然而体内的信号分子机制错综复杂，p-Cav1是否直接调控还是通过调控下游信号通路间接介导神经保护作用，还需要进一步深入研究。

综上所述，本研究结果表明抑制p-Cav1可以发挥脑缺血/再灌注后神经保护功能，其保护作用可能与减少星形胶质细胞和小胶质细胞激活及相互作用有关。