外源褪黑素降低黄瓜体内霜霉威残留的生理生化分析

吕 薇，李胜男，冯国军，杨晓旭，刘 畅，闫志山，刘大军

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150081）

0 引言

黄瓜(Cucumis sativus)隶属于葫芦科黄瓜属，果实营养价值丰富，是全国以及世界范围内广泛种植的一种蔬菜作物，也是深受人们喜爱的蔬菜之一[1]。黄瓜在生产过程中易受到各种常见病虫害的侵染，如霜霉病、灰霉病、炭疽病等，使其产量和品质受到严重影响。长期使用生物化学药剂进行病害防治，易导致黄瓜等蔬菜农药残留量超标，大量的农药残留会造成食品安全、环境污染等严重的社会问题。在黄瓜等蔬菜种植中，为有效控制病虫害的侵染，生产中经常使用多种杀虫剂进行病虫害的防治。其中，霜霉威（propamocarb，分子式为C9H20N2O2）是一种常用的杀菌剂，其作用方式主要有茎叶面喷施、土壤喷洒和种子的浸泡等方式[2]，主要功效是防治卵菌引起的叶部病害或土传病害，例如黄瓜、番茄、莴苣等蔬菜作物以及烟草、花卉、葡萄等作物的霜霉病、疫病、猝倒病等病害，总有效率达90%以上[3]，因高效、低毒的特性在国内应用广泛[4]。施用霜霉威后，霜霉威一部分会在黄瓜体内蓄积，其余沉降到土壤或扩散到大气中，一方面会造成黄瓜农药残留，影响品质，引发食品安全问题；另一方面造成环境污染，危害人类健康[5]。因此，研究黄瓜体内农药残留代谢对促进黄瓜安全生产具有现实意义[6]。现有研究表明，一部分残留在果蔬表面的农药可以通过水洗、浸泡、剥皮等方法不同程度去除，但另一部分农药会通过植物的叶根直接或间接吸收进入植物组织内部，最后残留在蔬菜体内[7]。关于农药的解毒和代谢机制已有了深入的研究。植物体在长期的外部环境刺激下已经逐渐进化出了一套应对有毒分子的代谢机制。植物体通过各种过氧化物酶、水解酶和转移酶的相互协调作用，将有毒的大分子基团代谢和水解形成低毒的小分子，小分子毒性物质通过降解运输到细胞外，最终减轻外源有毒物质对植物体的伤害，降低农药残留量[8]。

前人研究表明，外源施用一氧化氮[9]、胡敏素[10]、脯氨酸[11]等物质可以促进农药的代谢和解毒，降低植株中农药的残留量。褪黑素(melatonin，Mel)在植物抵抗逆境胁迫中具有重要的作用。外源喷施褪黑素可以减轻农药对番茄、莴苣、白菜、菠菜、芹菜、黄瓜和甜瓜产生的毒害，同时可以降低农药在这些作物中的残留量[12]。Mel的解毒作用主要是由于Mel激活了植株的抗氧化系统，提高植株的抗氧化能力，并参与关键的解毒过程[13]。以番茄为研究对象，外源施用Mel或过量表达Mel相关基因COMT1（可以直接清除农药产生的ROS，活性氧(ROS)和脂质过氧化物(LPO)水平显著降低。更重要的是Mel激活了抗坏血酸-谷胱甘肽(ASAGSH)循环，参与谷胱甘肽途径介导的百菌清解毒[14]。然而，目前关于褪黑素降低农药残留方面的研究鲜有报道。笔者以农药霜霉威为处理试剂，以黄瓜为供试材料，通过测定褪黑素处理对黄瓜体内残留霜霉威含量的影响，以及叶片的O2-·产生速率、H2O2含量、MDA含量、抗氧化酶和解毒酶活性的变化，研究外源褪黑素对霜霉威喷施黄瓜的抗氧化体系与解毒系统的调控作用，探究其对黄瓜体内霜霉威的作用，以期探索一条能有效降解蔬菜作物农药残留的新途径。

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理

供试材料为黄瓜品种‘Y3F604’，由黑龙江大学园艺学团队提供；以北京索莱宝科技有限公司的褪黑素（Mel，CAS为73-31-4）为灌根药剂；以氨基甲酯类农药霜霉威（CAS为24579-73-5，购于拜耳作物科学（中国）有限公司）为处理试剂。采用穴盘播种育苗，设置4个处理。处理1为根部浇灌蒸馏水(CK)、处理2为1 mmol/L褪黑素+根部浇灌蒸馏水，处理3为叶面喷施400 mg/kg霜霉威+根部浇灌蒸馏水，处理4为叶面喷施400 mg/kg霜霉威+黄瓜营养液中加入1 mmol/L褪黑素+根部浇灌蒸馏水。Mel持续处理2天，处理结束的7天后叶面喷施400 mg/kg的霜霉威，霜霉威处理结束后第24、48 h取第6片真叶测定霜霉威的残留量，并在48 h后取样，-80℃保存。每个处理20株黄瓜幼苗，设3个重复。

1.2 霜霉威残留量测定

采用高效气相色谱法测定黄瓜叶面喷施400 mg/kg霜霉威后叶片中的霜霉威含量，详细方法如下：（1）取10 g黄瓜叶片组织磨碎加入50 mL比色管中，加入20 L乙腈和2 g NaCl均质仪匀浆5 min，充分萃取；（2）上述溶液静置30 min后，取10 mL清液在旋转蒸发仪上蒸发近干；（3）用丙酮多次冲洗旋蒸瓶，洗液合并后定容至2 mL；（4）定容后的溶液用0.22 μm有机相滤膜过滤，可能需要多次，直至滤液中没有颗粒；（5）滤液用丙酮稀释100倍，通过安捷伦7890B-5977A气相色谱仪上机检测，色谱柱为HP-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 µm)。

1.3 抗氧化系统和解毒酶活性测定

黄瓜叶面喷施400 mg/kg霜霉威48 h后称取0.3 g样品，加入2 mL预冷的50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)，冰浴研磨，匀浆，4℃、12000 r/min下离心20 min，上清液为酶提取液。超氧化物岐化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定[15]，丙二醛(MDA)含量参照王学奎等[15]的方法测定，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[16]，过氧化氢酶(CAT)活性参照李合生的方法测定[16]，抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性采用紫外吸收法测定[17]，谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性参照赵世杰等[17]的方法测定，过氧化氢(H2O2)含量参考Rai等[18]试验方法，超氧阴离子(O2-·)含量参考Shah等[19]试验方法，还原型谷胱甘肽(GSH)参考Ma等[20]试验方法，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)参考Rahman等[21]试验方法测定，谷胱甘肽还原酶(GR)活性的测定参考Knorzer等[22]试验方法，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性的测定参考Komives等[23]的实验方法。

1.4 数据分析

对所得数据采用Microsoft Excel 2010进行处理并绘图，SPSS 21.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素处理对黄瓜体内霜霉威残留量的影响

由图1可知，Mel+霜霉威处理的黄瓜叶片中的农药霜霉威的残留量均显著低于喷施霜霉威处理，且较喷施霜霉威处理的霜霉威残留量分别降低了11.8%、29.6%。在霜霉威的胁迫下，48 h比24 h的Mel+霜霉威处理减少黄瓜叶片中霜霉威的残留量差异更显著。说明外源褪黑素处理下48 h比24 h能够更加有效地减少黄瓜体内霜霉威的累积。

图1 外源褪黑素处理对黄瓜体内霜霉威残留量的影响

2.2 外源褪黑素处理对农药胁迫下黄瓜体内O2-·产生速率和H2O2含量的影响

与CK相比，Mel处理中的黄瓜叶片中的O2-·和H2O2含量没有显著差异（图2），仅施用Mel对黄瓜叶片中的O2-·和H2O2的含量不产生明显影响。而叶面喷施霜霉威后，黄瓜叶片的O2-·和H2O2含量显著积累。与喷施霜霉威相比，Mel+霜霉威处理均显著降低了黄瓜体内O2-·、H2O2含量，分别降低了24.2%、19.7%，但是未恢复到对照水平。说明外源Mel处理能在一定程度上缓解由霜霉威胁迫造成黄瓜体内O2-·和H2O2含量的累积。

2.3 外源褪黑素处理对农药胁迫下黄瓜体内MDA含量的影响

与CK相比，Mel处理中黄瓜叶片的MDA含量差异不显著（图3），仅施用Mel对黄瓜体内的MDA含量不产生显著影响。而叶面喷施霜霉威后，黄瓜叶片中的MDA含量显著升高。与喷施霜霉威的处理相比，Mel+霜霉威处理下黄瓜叶片中的MDA含量显著降低，降低了23.4%，但未恢复到对照水平。说明外源Mel处理能在一定程度上缓解由霜霉威胁迫造成的MDA含量积累。

2.4 外源褪黑素处理对农药胁迫下黄瓜体内GSH/GSSG比值的影响

如表1所示，与CK相比，外源Mel处理的植物在GSSG和总谷胱甘肽含量上没有显著差异，但外源Mel处理后GSH含量降低了6.5%。而叶面喷施霜霉威后，黄瓜叶片中显著增加了GSH的含量，增加了60.9%，而GSSG含量显著降低，降低了34.2%，GSH/GSSG增加。与霜霉威相比，Mel+霜霉威处理后GSH含量显著增加，增加了10.8%，总谷胱甘肽含量增加了7%，GSH/GSSG也显著增加。说明外源褪黑素处理显著诱导霜霉威胁迫下GSH和总谷胱甘肽含量的积累，并且GSH/GSSG增加。

表1 外源褪黑素对农药胁迫下黄瓜体内GSH-GSSG含量的影响

2.5 外源褪黑素处理对农药胁迫下黄瓜体内抗氧化酶活性的影响

与CK相比，Mel处理的黄瓜体内抗氧化酶活性均无明显差异（图4）。而叶面喷施霜霉威后，显著提高黄瓜叶片中的抗氧化酶活性。与喷施霜霉威相比，Mel+霜霉威处理黄瓜叶片中的SOD、POD、CAT、APX和GPX等抗氧化酶活性显著增强，分别增加了24.2%、25.6%、25.3%、16.1%、25.0%。说明外源Mel处理能激活霜霉威胁迫下黄瓜体内抗氧化酶活性。

图4 外源褪黑素处理对农药胁迫下黄瓜体内抗氧化酶活性的影响

2.6 外源褪黑素处理对农药胁迫下黄瓜体内解毒酶活性的影响

与CK相比，外源施用Mel降低了GST和GR酶活性，但差异不显著（图5）。而叶面喷施霜霉威后，黄瓜中的GST、GR酶活性均显著增强。与喷施霜霉威相比，Mel+霜霉威处理黄瓜叶片中的GST和GR酶活性显著增强，分别提高了22.4%、25.4%。说明外源Mel处理在霜霉威胁迫下能增强GST和GR酶的活性。

图5 外源褪黑素处理对农药胁迫下黄瓜体内解毒酶活性的影响

3 结论

外源褪黑素处理可以提高霜霉威胁迫下黄瓜叶片中的SOD、CAT、POD、APX、GPX等抗氧化酶活性，减少MDA积累，并提高GSH/GSSG，通过清除植物细胞内产生O2-·和H2O2等活性氧，促进解毒酶GR和GST酶活性，促进GSH含量的增加，进而加快霜霉威在黄瓜体内降解代谢。本研究以对蔬菜进行内源调控为基础，探索了一条减少蔬菜农药残留的新途径，为褪黑素在果蔬绿色生产与农药调控降解技术中的应用提供了理论参考。

4 讨论

在环境胁迫下，植物体内活性氧的产生和清除的动态平衡状态会被打破，使植物细胞增加了活性氧的产生[24]。活性氧（O2-·和H2O2）作为细胞的第三信使调节许多不同的基因和蛋白质，从而产生对各种胁迫环境的反应[25]。在农药胁迫下，植物细胞体内产生积累的ROS是有氧代谢带来的有毒副产物，并且会导致质膜损伤[26]。本研究中，霜霉威胁迫后，黄瓜体内的O2-·和H2O2含量均显著高于对照组，且MDA含量也显著增加，说明黄瓜植株已受到ROS胁迫。植物遭受ROS胁迫时，抗氧化防御系统包括抗坏血酸-谷胱甘肽系统和SOD、POD等抗氧化酶系统会迅速启动[27]。而外源Mel处理可以减少植物在遭受农药胁迫下ROS的累积，增强黄瓜体内氧化还原信号分子介导的抵抗防御反应，从而促进农药的氧化降解[28]。本研究表明，外源Mel处理减少了在霜霉威胁迫下O2-·和H2O2累积，显著降低了霜霉威诱导的MDA积累，这与刘娜等[29]的结果相似。这可能是Mel处理引起细胞内抗氧化酶SOD、CAT、POD、APX和GPX酶活性增加，加速ROS的清除，在此过程中，SOD清除O2-·并转化为H2O2，而通过CAT、POD、APX和GPX酶进一步清除H2O2[30]，从而减少植株体内的ROS积累，减轻霜霉威对植物的毒害。MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，MDA积累可能会对膜和细胞造成一定的伤害，其含量可以反映植物遭受逆境的伤害程度[31]。本研究中外源Mel处理显著降低由霜霉威诱导的MDA积累，减缓细胞的膜脂过氧化作用，从而降低植物受到的霜霉威毒害。魏志为等[32]研究发现，褪黑素可有效增强苹果植株的抗氧化能力，从而有效减轻苹果在逆境胁迫下所受到的应激损伤。付晴晴等[33]在葡萄上和张俊康等[34]在猕猴桃上通过研究得出类似的结论。本研究结果表明，在霜霉威的胁迫下，外源Mel处理可提高在霜霉威胁迫下植株体内SOD、CAT、POD、APX和GPX等抗氧化酶活性，并减少MDA的积累。

此外，谷胱甘肽还原酶GR和谷胱甘肽也在植物细胞抗氧化过程中发挥作用。GR不仅是植物细胞内H2O2清除酶系统的主要组成之一，也是植物谷胱甘肽解毒系统的主要组成[35]，与谷胱甘肽-S-转移酶在植物内残余农药的降解过程中发挥重要的解毒作用[36]。有科学研究证明，Mel处理能够增强GR的活性，促进氧化态型胱甘肽GSSG的还原，进而促进GSH的再生，同时GSH/GSSG比值增加有利于ROS的清除[37-38]。本研究表明，外源Mel处理可显著提高农药胁迫下黄瓜GR，提高GSH/GSSG和GST酶活性，进而显著提高植株抗氧化能力和解毒能力，并促进黄瓜对霜霉威的降解。阮海华等[39]研究表明，盐胁迫可使小麦GSH/GSSG比值增加；韩一林等[40]研究表明，高温干旱和协同胁迫显著增加毛竹GSH/GSSG的比值；孙舒畅等[41]研究表明，外源Mel预处理对镉胁迫下的番茄植株GSH/GSSG显著增加。GSH与GSSG的比值反映细胞是否受到氧化应激。Mel调控植物在逆境下的抗氧化能力和氧化还原平衡至关重要。本研究发现，在霜霉威胁迫下，外源Mel处理增加了黄瓜体内GSH和总谷胱甘肽含量的累积，减少GSSG含量，从而提高GSH/GSSG，激活黄瓜植株抗氧化酶活性，提高抗氧化能力。还原型谷胱甘肽GSH为植物体内抗氧化还原非酶系统的关键成员，在植物遭受逆境胁迫时，所产生的活性氧既可由酶促作用或非酶促作用去除，也能利用ASA-GSH循环来调节GSH/GSSG氧化还原，清除ROS[42]。在植物中，谷胱甘肽可以减少植物受到胁迫造成的ROS积累，并降低其对植物机体的损伤效果[43]。此外，谷胱甘肽与异源有毒性化学物质紧密结合，在GST酶的催化相互作用下，加速有害物质降解[44]。本研究结果表明，外源Mel处理可增强GST、GR解毒酶的酶活性，增加GSH和总谷胱甘肽的累积，使GSH/GSSG升高，增强植株的解毒能力，并加速黄瓜体内霜霉威的降解。基于ROS和谷胱甘肽在植物解毒途径中功能的保守性，本实验未能探究褪黑素应用于其他蔬菜残留农药降解代谢的调控效果，具体的调控效果尚有待于进一步研究。