基于DNA序列的‘和田’玫瑰遗传背景分析研究

宋 垚，王 辉

（上海植物园/上海城市植物资源开发应用工程技术中心，上海 200231）

0 引言

‘和田’玫瑰为国内主栽的玫瑰品种之一，主要分布和栽培于新疆和田地区，位于新疆维吾尔自治区南隅和墨洛绿洲（和田、墨玉、洛浦三县）。栽培面积约4333 hm2（2022年统计），主要生产加工玫瑰花酱、干花蕾、精油、纯露和化妆品等产品[1-2]。‘和田’玫瑰通常被称为突厥玫瑰，当地又叫小红刺玫、高原玫瑰，从300年前有栽种，没有史料记载来源，因其名为突厥，同大马士革的音译相同，形态也有些相似，因此有些研究中将其归为大马士革玫瑰(Rosa damascena)一类[3-4]；又因花为重瓣红色，在产品应用上可以免除法规限制又有归为重瓣红玫瑰(Rosa rugosa‘Plena’)[5]。遗传背景不明确，不利于产品标准化和推广应用。有研究分析国内食用玫瑰的遗传背景[6]，主要是云南分布和栽培的，并未将‘和田’玫瑰包含在内。‘和田’玫瑰为国内主栽食油用玫瑰，有必要就其遗传背景开展研究。本研究拟选取形态或成分上的近缘种或疑似亲本，通过对ITS与叶绿体基因测序结果的分别比对与综合分析，来确定‘和田’玫瑰的遗传背景，澄清品种归属，为后续开发利用提供更多支撑。

1 材料与方法

1.1 植物材料

用于遗传背景分析的植物材料共12份，列于表1，其中11份于2020年6—8月期间采于上海植物园苗圃。选取发育成熟度一致的叶片，采集后放入-70℃冰箱中冷冻备用。

表1 试验材料

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序

采用植物基因组DNA快速抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]进行总DNA提取。PCR扩增体系为：10× rTaq buffer(Mg2+plus)2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μL，正反向引物（表2）各0.75 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板0.3 μL，ddH2O补足到25 μL。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳在紫外分析仪检测后（图1）送生工生物工程（上海）股份有限公司进行克隆测序。

图1 部分材料ITS序列琼脂糖凝胶电泳扩增产物

表2 试验选用的正反向引物

1.3 数据处理

对获得的序列进行联合分析，在MEGA4中采用领接法[7](neighbor-joining method，NJ)构建系统进化树，1000次抽样进行自展分析[8](Bootstrap analysis)，根据抽样自展支持率(Bootstrap value，BS)评估系统树各分支的可靠性，确定物种的进化关系及其在分子分类学上的地位[9-10]。

2 结果与分析

2.1 基于ITS序列遗传背景分析

在核糖体(nrDNA)中，ITS区位于18S和26S rRNA基因之间，被5.8S rRNA基因分为2段，在被子植物中，ITS序列中核苷酸变异程度高但长度变异相对较稳定，通常ITS1和ITS2的长度均不足300 bp，PCR扩增及测序简单易行，因为自身较快的进化速率，其在较低分类阶元（近缘属种）中解决系统树末端分支的系统关系时更具有优越性[11]。由于ITS序列具有较快的进化速率和物种特异性，因此，其在用于研究亲缘关系较近的属间、组间或属内种间关系时，可以较好地反映出被研究类群的谱系发生关系[12-14]。

试验共测得ITS序列11个，腺果蔷薇序列引自Genebank（序列号AB043822.1）。采用12个ITS序列构建系统树见图2b。在系统进化树中，麝香蔷薇在系统树的外侧，内部分支中腓尼基蔷薇、大马士革蔷薇、法国蔷薇在一个分支内，玫瑰、大花香水月季、百叶蔷薇、腺果蔷薇在一个分支内，‘和田’玫瑰、‘墨红’、‘月月粉’与‘滇红’为平行分支。进化树显示腓尼基蔷薇与大马士革蔷薇亲缘关系较近，而大花香水月季与玫瑰亲缘关系较近。

图2 基于ITS序列获得的系统树

单独采用ITS1序列构建系统树见图2c，除了麝香蔷薇由系统树的外侧移到内部和‘月月粉’、‘滇红’、‘和田’玫瑰聚为平行分支，‘墨红’由平行分支聚到腓尼基蔷薇、大马士革蔷薇和法国蔷薇的分支内，其他和ITS序列的结果基本相同。单独采用ITS2序列构建系统树见图2a。在系统进化树中，大花香水月季与玫瑰、腺果蔷薇、百叶蔷薇、麝香蔷薇在一个分支内，‘墨红’和‘月月粉’在一个分支内，大马士革蔷薇、腓尼基蔷薇、‘和田’玫瑰和法国蔷薇属于一个分支。处于一个分支内说明其遗传关系更近。在ITS2的聚类中没有更多的独立单独分支，‘和田’玫瑰和法国蔷薇聚类一起，说明其亲缘关系更近。基于ITS2的聚类树能获得更多的信息。

2.2 基于atpB-rbcL区间的分析结果

atpB-rbcL区间位于叶绿体编码基因的间区，长度一般约542～568 bp，常可用于科间、属间或族间亲缘关系分析[15]。采用测出的11个atpB-rbcL区间构建的系统树见图3。在系统进化树中，‘墨红’在进化树的外侧，在内侧‘和田’玫瑰与法国蔷薇、百叶蔷薇、腓尼基蔷薇和玫瑰在一个分支内，大马士革蔷薇与麝香蔷薇属于一个分支，‘滇红’和大花香水月季、‘月月粉’为另外3个分支。atpB-rbcL区间用于种之间的亲缘关系分析多态性略低，聚类分析中出现许多平行分支，但叶绿体中的基因序列有母系遗传的特性，因此可以反映对应的母本情况。麝香蔷薇应为大马士革蔷薇的母本，法国蔷薇、腓尼基蔷薇之一为‘和田’玫瑰的母本。结合ITS2的聚类结果，推测法国蔷薇为‘和田’玫瑰的母本，与大马士革蔷薇有共同亲本起源。

图3 基于atpB-rbcL区间序列获得的系统树

3 结论

为搞清‘和田’玫瑰的遗传背景，选择近源种，采用ITS和atpB-rbcL序列比对的方法，通过构建系统树来分析其亲缘关系。结果显示ITS序列多态性较高，尤其是ITS2序列能够获得更多的遗传信息，在构建的系统树中‘和田’玫瑰与法国蔷薇、大马士革蔷薇、腓尼基蔷薇常聚到一起，说明其亲缘关系较近，尤其是‘和田’玫瑰和法国蔷薇基于ITS2序列的NJ树两者聚为一个小分支，说明其亲缘关系较近，这和形态对比的结果相符。atpB-rbcL序列在被测植物材料间的多态性比较低，但可以反映母本信息，‘和田’玫瑰与法国蔷薇、百叶蔷薇、腓尼基蔷薇和玫瑰在一个分支内，大马士革蔷薇与麝香蔷薇属于一个分支，结合ITS的聚类结果，推测法国蔷薇为‘和田’玫瑰的母本，与大马士革蔷薇有共同亲本起源。

4 讨论

‘和田’玫瑰作为国内主栽的玫瑰品种之一，多与其他主栽玫瑰品种混淆，其遗传背景不明确已经对其推广应用造成影响。本研究立足蔷薇属植物资源，比较全面地选择其易混淆种、疑似亲本，采用2种分子序列比对的方法分析其亲缘关系，明确遗传背景，得出一些有意义的研究成果。本研究在品种的选择上首先考虑‘和田’玫瑰和大马士革蔷薇的亲缘关系。据文献报道，大马士革蔷薇有麝香蔷薇和法国蔷薇杂交起源，以及腓尼基蔷薇和法国蔷薇杂交起源的双源起源说[16-17]，还有腺果蔷薇、麝香蔷薇、法国蔷薇三源起源[18]的说法。为了考察是否有共同的亲本起源，本研究将几种亲本都包括在内。研究证明，‘和田’玫瑰与大马士革蔷薇有相似的亲本起源，即腓尼基蔷薇和法国蔷薇，另外，大马士革蔷薇和麝香蔷薇在叶绿体基因的比对中距离也较近。有研究者采用psbA-trnH+trnL序列来探究‘和田’玫瑰的遗传地位，‘和田’玫瑰和法国蔷薇只有一个碱基的差异，距离较近，‘和田’玫瑰与腓尼基蔷薇较近，大马士革蔷薇与麝香蔷薇较近，两者与腺果蔷薇的距离都较远[19]，在与大马士革蔷薇的亲缘关系上和本研究得出结论基本一致。‘和田’玫瑰的原产地和田位于丝绸之路南段，和中亚东欧联系紧密，推测其起源可能为本地种和原产中东地区的蔷薇杂交而来。腺果蔷薇产自中国新疆[20]，通过本研究序列比对，‘和田’玫瑰与腺果蔷薇聚类较远，而在Iwata的研究中腺果蔷薇为大马士革蔷薇的亲本，两者存在不同。另外本研究选取了百叶蔷薇、玫瑰等与‘和田’玫瑰疑似近源种或易曲解混淆种来分析遗传距离远近，证明‘和田’玫瑰与百叶蔷薇和玫瑰基于ITS序列亲缘关系均较远，而基于atpB-rbcL序列关系较近，与玫瑰较近可能与野生种序列本身多态性比较低有关，而与百叶蔷薇较近可能是两者有共同的母本[21]。选择‘墨红’、‘滇红’、大花香水月季、‘月月粉’旨在考察与食用玫瑰[22]及月季的亲缘关系，研究证明这几个种（品种）的序列多位于平行分支，遗传距离较远。

通过本研究，基于遗传距离远近，基本明确‘和田’玫瑰与易混淆种的关系，在选择的疑似亲本中锁定法国蔷薇为‘和田’玫瑰的母本，与大马士革蔷薇有共同亲本起源。在其系统起源的判断上，鉴于选材具有主观倾向性，可能不全面，需要更多蔷薇属植物资源遗传序列，在方法上也需要更多序列信息来佐证，或者通过测序来明确。另外，通过植化成分的研究可以提供更多的支撑[23-24]。有研究者包括作者之前对精油成分的研究[25]，得出‘和田’玫瑰与大马士革蔷薇比较接近，可以证明亲缘关系较近。精油成分的研究在应用层面具有更多意义，‘和田’玫瑰精油国家标准已批准实施，明确了其遗传背景，可以依据其亲缘属性来制定，并进一步指导产品的研发和应用方向。