姜黄素对骨质疏松鼠模型作用机制的研究

王铜浩，田永刚，韩立强，郭树章

（天津市第三中心医院骨科/天津市重症疾病体外生命支持重点实验室/天津市人工细胞工程技术研究中心/天津市肝胆疾病研究所，天津 300170）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种代谢性骨骼疾病，主要特征是骨量减少、骨微结构破坏，导致骨脆性增加、易发生骨折。目前根据不同类型骨质疏松研发了多种动物模型，包括去卵巢动物模型、糖尿病性动物模型、糖皮质激素诱导的动物模型、老年痴呆性动物模型、废用性动物模型等，这些动物模型的建立对骨质疏松发病机制及药物防治的研究起到了至关重要的作用。近几年在众多抗骨质疏松的药物中，姜黄素的研究及应用得到越来越多的关注。姜黄素是从姜黄根部提炼的最主要的色素成分，是一种历史悠久并用于治疗多种疾病的草本药物[1]。研究表明[2，3]，姜黄素具有多种药理学活性，如抗氧化和抗炎作用、降血糖作用、神经保护作用、抗结核作用和抗癌活性，还可以通过促进破骨细胞凋亡和抑制破骨细胞分化而显著抑制破骨细胞介导的骨吸收[4]。动物模型研究发现，姜黄素通过调控多种细胞因子及信号通路调节骨重塑，提高骨密度，有效治疗骨质疏松症。因此，本文就姜黄素对不同骨质疏松动物模型的治疗作用进行综述，为研究姜黄素治疗骨质疏松的药理机制奠定基础，并为姜黄素进一步临床应用提供理论依据。

1 卵巢切除去势骨质疏松鼠动物模型

绝经后骨质疏松是骨质疏松症的最常见的一种类型，主要是由于低峰值骨量、激素缺乏以及衰老导致的骨丢失。在雌激素缺乏的状态，由于骨吸收增加而骨形成减少导致骨小梁数量减少、骨体积分数百分比降低、间距增加[5]。以双侧卵巢摘除（ovariectomize，OVX）形成的骨质疏松大鼠模型可模拟雌激素缺乏时由于破骨细胞功能亢进和骨更新加快而导致的小梁骨过度丢失，已被证实能代表老年女性雌激素缺乏（或绝经后）导致骨丢失的一些最重要临床特征[6]，也是目前研究原发性骨质疏松最常用的模型，还是目前研究姜黄素体内骨保护作用的主要研究模型[7]。研究发现[8]，随着年龄的增加，细胞线粒体功能减弱，机体的抗氧化应激系统清除能力下降，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增多，机体表现为氧化应激，从而诱导成骨细胞的凋亡或死亡，抑制其增殖、分化，减弱成骨细胞的矿化作用，诱发骨质疏松。同时，氧化应激能刺激破骨细胞的形成、分化和骨吸收作用，促进骨质疏松的发生发展。持续的氧化应激可激活NF-κB，促进肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（IL-6）等相关炎症过度表达，IL-6 是骨吸收明显的促进剂，促进破骨细胞前体的分化，增加破骨细胞活性，促进骨吸收，而血清TNF-α 水平升高则直接刺激破骨细胞的成熟与活化，并刺激成熟的破骨细胞分泌IL-6[9]，二者共同促进破骨细胞形成，使骨吸收增加，导致骨质疏松发生。除了炎性反应，氧化应激（OS）诱导的骨质疏松功能障碍也是骨质疏松症的主要病理机制，而姜黄素可通过调控NF-κB/IL-6信号通路作用，从而抑制炎症反应[10]，并且姜黄素可通过激活叉头框蛋白O（FoxO）3a/分泌型糖蛋白（Wnt）信号通路，有效缓解氧化应激介导的去卵巢大鼠骨质疏松[11]。另外姜黄素可抑制糖原合成酶激酶（GSK3+）和激活核因子红细胞2 相关因子2（Nrf2）减少氧化应激，从而有望治疗骨质疏松[12]。此类药理作用可能是姜黄素拮抗卵巢切除致骨质疏松症的途径作用之一。除了氧化应激及炎性介导的信号通路之外，骨保护素（OPG）/RANKL 信号通路也是成骨细胞与破骨细胞相互作用机制中较重要的通路，与OP 发病机制密切相关。研究发现姜黄素能够改善去势骨质疏松模型大鼠的骨代谢水平，增加其BMD、改善骨小梁微结构、抑制骨吸收,这种作用可能与调控OPG/RANKL 信号通路有关[13]。

除上述机制外，组蛋白赖氨酸甲基转移酶（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是骨髓间充质干细胞成骨过程中最突出的表观遗传学酶之一，可控制成骨细胞分化。去势后，EZH2mRNA 在下颌骨和股骨中的相对表达量增加，提示EZH2 mRNA 水平的增加与雌激素的减少有关，而应用姜黄素治疗后去势骨质疏松大鼠体内EZH2mRNA 表达水平显著下调，骨微结构明显改善，骨密度增加，说明姜黄素治疗去势大鼠骨质疏松的机制可能与下调EZH2mRNA的表达水平有关[14]。

总之，姜黄素对去势骨质疏松鼠模型治疗主要通过FoxO3a/Wnt 信号，NF-κB/IL-6 信号通路抗氧化、抗炎，通过OPG/RANKL 信号通路调节成骨细胞与破骨细胞平衡，通过升高Axin2 基因，下调EZH2mRNA 表达水平等机制治疗绝经后骨质疏松。

2 糖皮质激素诱导的骨质疏松鼠动物模型

长期糖皮质激素治疗与骨质疏松症的发病率有关，骨质疏松症是糖皮质激素治疗最严重的副作用之一。糖皮质激素诱导的骨质疏松症（glucocorticoidinduced osteoporosis，GIOP）主要是由于成骨细胞和骨细胞的凋亡以及破骨细胞生存周期的延长引起，研究表明[15]，成骨细胞凋亡及其导致的骨形成减少和骨脆性增加在糖皮质激素诱导的骨丢失和骨质疏松的发生发展过程中起至关重要的作用。给予大鼠腹腔注射地塞米松能明显损害股骨骨小梁结构并显著降低其机械强度，形成激素诱导的骨质疏松鼠模型。Bcl-2 是一种抗凋亡蛋白，在糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡中起重要作用，而Bax 是一种促凋亡蛋白，Bax/Bcl-2的比值在多种细胞生存过程中起“凋亡开关”的作用。研究发现[2]，姜黄素预治疗可以显著扭转地塞米松对于Bax 表达的促进作用以及对Bcl-2 表达的抑制作用，导致的Bax/Bcl-2 比值降低，从而起到对抗GIOP的作用。Wnt/β-catenin 信号通路在人体的生长、发育和器官功能的维持中起重要作用，成骨细胞中的Wnt/β-catenin 信号通路激活能够诱导OPG的表达而抑制破骨细胞分化，姜黄素可以通过对MicroRNA（miR-126a-3p）表达的调节，以浓度依赖的方式抑制间充质干细胞分化引，并且通过调控Wnt/β-catenin 信号通路治疗骨质疏松[16]。

糖皮质激素可向下调骨蛋白（OPG）和向上调节核因子Kappa-+配体（RANKL）的受体活化剂（RANKL），通过改变RANKL/OPG 轴引起骨质疏松。除此之外，糖皮质激素可以通过下调RunX2 抑制间质干细胞的骨质分化，通过引起氧化应激加速骨细胞凋亡，导致骨细胞增殖抑制[17]，而姜黄素能够调控OPG/RANKL 信号通路，增加其BMD、改善骨小梁微结构、抑制骨吸收[13]。

基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是一种依赖锌的内含酶，在骨生物学中，MMP-9 是由骨细胞产生，在细胞外基质的降解中起着重要作用。研究还发现[18]，MicroRNA（miR）-365 是MMP-9的调节器，可能与糖皮质激素引起的继发性骨质疏松症有关，通过姜黄素治疗可以抑制MMP-9 在GIOP 小鼠头骨中的表达，进而激活miR-365，对GIOP 小鼠骨质恶化起到保护作用。

3 老年痴呆性骨质疏松鼠动物模型

老年性痴呆症又称阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是临床上最为常见的老年性疾病，其合并骨质疏松发生比例较高。β-淀粉样蛋白（Aβ）、APOE4、维生素K 和维生素D 可能是老年痴呆和骨质疏松相互联系的重要因素[19]。APP/PS1（β 淀粉样蛋白前体蛋白/早老素1）转基因鼠大脑皮质内含有类似于AD 患者脑内的Aβ 老年斑，是AD 研究领域的最佳动物模型[20]。研究发现[21]，APP/PS1 转基因组小鼠胫骨近端骨微结构、骨密度参数与野生型小鼠相比存在明显的差异，APP/PS1 转基因组小鼠更易患骨质疏松，应用姜黄素治疗后，APP/PS1 转基因组小鼠骨微结构的明显改善，骨密度增加，推测可能机制是姜黄素能够减少Aβ，调节免疫功能，抑制炎症因子的释放，进而通过治疗AD，达到防治老年痴呆性骨质疏松的目的。Wnt/β-catenin 信号转导通路是一种重要的信号转导通路，可调节包括细胞生存在内的许多细胞过程，可抑制淀粉样蛋白-β的产生，在Alzheimer disease 和骨质疏松的发病过程中起着重要的作用[22]，姜黄素可能通过调控Wnt/β-catenin信号转导通路治疗骨质疏松。除此之外，在AD 转基因小鼠模型体外和体内检测均显示骨组织中Aβ 表达增强，同时骨髓腔内脂肪组织形成增加，同样在人椎体小梁骨标本中发现信使RNA，Aβ42 和APP的表达明显增加，而Aβ的增加骨密度的变化存在一定的相关性，其可能原因是异常表达的Aβ 沉积似乎会干扰RANKL 信号级联，进而影响骨形成和骨吸收之间的平衡，导致骨质疏松[23]。可见除了炎性因子，Aβ 在老年痴呆性骨质疏松发病过程中同样起到至关重要的作用。姜黄素对APP/PS1 转基因组小鼠体内炎性因子和Aβ 都有一定清除作用，这可能是姜黄素治疗老年痴呆性骨质疏松的主要机制，但还有待进一步研究。

4 废用性骨质疏松鼠动物模型

废用性骨质疏松症（disuse osteoporosis，DOP）是由于机械应力刺激减少所引发，以骨量丢失为主要特征且易发生骨折的疾病，属继发性骨质疏松的一种。大鼠尾巴悬吊模型即后肢悬浮模型，该模型由美国宇航局建立，被世界公认为模拟骨丢失的有效废用性骨质疏松模型[24]。目前对废用性骨质疏松防治药物主要以西药为主，但因副作用大、价格昂贵、药效不持久，使人们不得不寻找新的药物替代，中医药现在已经成为国内骨科界研究的重点方向。黑木耳肽-钙复合物（AP-Ca）具有抑制废用性骨质疏松症引起的骨丢失的潜力，对废用性骨质疏松症引起的骨质丢失具有保护作用，为患者和宇航员减少废用性骨质疏松症的风险提供了新的选择[24]。李凯等[25]研究发现，葛根素对DOP 大鼠模型具有防治作用且效果良好，其作用机制可能与促进骨形成和抑制骨吸收有关。而对于姜黄素的治疗近几年研究较少，姜黄素可大大改善吊尾大鼠引发的骨质丢失，其机制主要与其抑制氧化应激作用有关，而增加维生素D 受体（VDR）的表达也可能是其中一个原因[16]。废用性骨质疏松有关的信号通路包括RANKL/RANK/OPG 通路、Wnt/β-catenin 通路、PPAR-γ 通路以及戊糖分流通路等[26]，姜黄素对其中的一些信号通路的调控可影响其他类型的骨质疏松，但是否适用于废用性骨质疏松，还有待进一步研究。

5 糖尿病性骨质疏松鼠动物模型

糖尿病性骨质疏松是一种由糖尿病诱发的慢性骨代谢疾病，约1/2～2/3的糖尿病患者伴有骨强度的下降，其中有近1/3的患者可诊断为骨质疏松。有研究发现，糖尿病大鼠[27]和糖尿病绝经期妇女[28]骨组织中组织蛋白酶K（Cathespin K）的表达水平明显升高，从而促进破骨细胞的活化和骨吸收增强。因此，Cathespin K 在糖尿病性骨质疏松的发生和发展过程中有重要的作用。马如风等[29]研究结果表明，姜黄素能够明显抑制股骨和胫骨组织中Cathespin K的蛋白表达水平，进而保护高脂诱发的骨质恶化。Hie M 等[30]用链脲霉素诱导大鼠糖尿病模型并补充姜黄素，8 d 后获得骨髓细胞并体外培养，其中糖尿病组大鼠骨髓细胞形成抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）（+）细胞的能力更强。而补充姜黄素可降低TRAP（+）细胞数量至接近对照组水平。结果表明姜黄素通过抑制糖尿病大鼠细胞内c-fos 蛋白和c-jun蛋白表达，从而抑制激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）表达，降低破骨细胞前体数量，从而抑制骨吸收活性的增加。

转化生长因子-β1（TGF-β1）由成骨细胞分泌，促进成骨细胞分化，抑制骨细胞活性[31]。研究发现[32]，2 型糖尿病大鼠在骨骼受损时表现出较低的TGF-β1表达；然而，增加TGF-β1水平可起到保护骨骼的作用，因为它可减缓骨质流失和延迟糖尿病损伤。应用姜黄素治疗糖尿病大鼠可增加骨组织中TGF-β1mRNA 表达，并促进了Smad2/3 磷酸化，表明姜黄素的影响可以通过TGF-β/Smad2/3 通路激活介导，改善骨生物力学特性[33]。

6 总结

姜黄素对原发和继发性骨折疏松都有一定的治疗作用，其作用机制包括姜黄素抗炎，抗氧化的药理作用，对β-catenin、Bax/Bcl-2、c-fos、c-jun、Aβ 等蛋白和Cathespin K、EZH2、MMP-9 等酶类的调控，以及 对 NF -κB、OPG/RANKL、FoxO3a/Wnt、Wnt/β -catenin、TGF-β/Smad2/3 等信号通路的调控，从而影响体内破骨细胞及成骨细胞的含量，维持骨重塑的动态稳定性，治疗骨质疏松。近年来，虽然姜黄素这些药理作用以及姜黄素的有效性和安全性得到了多方证实，但是其较差的生物利用度仍是目前制约其应用的主要问题。更多骨质疏松动物模型的建立，以及姜黄素进一步药理机制的研究，将为开发防治骨质疏松的临床药物奠定理论基础，相信不久的将来姜黄素的应用前景会更加广阔。