地中海贫血的诊疗现状及分子生物学研究

吕丽娜，杨灿华

（广西医科大学附属武鸣医院血液内科，广西 南宁 530199）

地中海贫血（thalassemia）又称珠蛋白生成障碍性贫血，是临床常见的遗传性血红蛋白病，其发病机制与调控珠蛋白合成的基因缺失或突变有关，可引起血红蛋白α 链及β 链珠蛋白合成比例的失衡，导致红细胞寿命缩短，促使溶血性贫血的形成[1]。近年来，该疾病的诊断及临床治疗方面取得了不小进展，但仍是全球分布最为广泛的遗传学疾病之一，多伴有脾脏肿大、骨骼畸形、生长发育迟缓、铁过载以及心脏疾病等问题，对其身体健康造成了严重影响[2]。基于此，该病的诊治方案及研究进展获得了临床的广泛关注，现本文对地中海贫血诊疗现状及分子生物学研究综述如下，以期为该病的临床研究提供相应的参考信息。

1 地中海贫血的诊疗现状

1.1 诊断 现阶段，基因诊断是地中海贫血最为准确的诊断方式，对于该病的早期检查具有较高的可靠性，现已广泛应用于孕妇产前检查中[3]。目前，国内医院多以实验室血细胞检查作为地中海贫血的首选筛查方式，首先对小细胞低色素性贫血进行初步诊断。诊断标准：血红蛋白、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）以及平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）降低；随后进行血红蛋白分析，HbF、HbA2 增多，或血红蛋白电泳出现其他异常血红蛋白；最后，在发现明确珠蛋白变异情况下再行基因诊断[4]。

1.2 治疗 目前，地中海贫血的常用治疗方式包括输血治疗、去铁治疗、造血干细胞移植、脾切除术、基因治疗等。国际地中海贫血联盟（TIF）指南指出，适当的规范性输血计划是治疗地中海贫血的常规方式，但需明确其输血时间、血红蛋白最佳标准、对去铁治疗的影响，以及输血反应等问题[5]。我国则主要参考中华医学会儿科学分会血液学组的地中海贫血诊断与治疗指南，以长期规范性输血治疗为主，在人类白细胞抗原（HLA）相合的情况下，首选造血干细胞移植治疗；当输血次数超过10～20 次、血清铁蛋白＞1000 μg/L 时考虑开展去铁治疗；对于12 岁以下患儿尽量不采用脾切除术治疗[6]。此外，基因活化治疗是当前的重要研究方向，应用化学药物可改善β 地中海贫血的临床症状，但目前仍然在研究中。总之，输血联合铁螯合剂去铁仍是地贫患者最主要的治疗方法。

2 地中海贫血的分子生物学研究

2.1 疾病分子生物学研究 地中海贫血是由于调控珠蛋白合成的基因缺失或突变引起的溶血性贫血，根据基因分型，可分为α、β、δβ、δ 地中海贫血等，以前两者最为高发。α-地中海贫血主要是由于α-珠蛋白基因的大片段缺失所导致，其缺失型包括--SEA、-α3.7、-α4.2，少数是由小片段碱基插入、缺失或点突变所致，属于包括非缺失型，包括αWS、αCS、αQS[7]。β-地中海贫血则主要是由于11（p15.5）染色体上β 珠蛋白基因点突变所致，少数是由β-珠蛋白基因缺失引起，按照珠蛋白链的缺失程度可分为β+（轻型突变）与β0（重型突变），其症状表现也有所差异[8]。

2.2 分子生物学诊断及应用

2.2.1 Southern 印记杂交 Southern 印记杂交是DNA图谱的重要分析方式，该技术可通过琼脂糖凝胶电泳法分离限制性内切酶，随后完整转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上相应位置，与放射性同位素标记的DNA 进行探针杂交，随后通过放射性自显影确定杂交片断的大小与位置，是当前检测α-珠蛋白基因缺陷的金标准[9]。但Southern 印记杂交操作繁琐，费时费力，对所用基因组DNA 质量具有较大依赖性，且需用到放射性同位素，不适用于临床的常规诊断。

2.2.2 缺口聚合酶链式反应（gap-PCR）缺口PCR 常用于缺失型突变的检测，该技术可针对缺失区域上下游序列设计互补引物，正常情况下，引物距离较远无法扩增出特异片段，当上下游序列发生缺失突变时，引物之间的距离因断端连接而靠近，由此可扩增出特定长度的片段，后续可通过琼脂糖凝胶电泳所得片段，检测其样品的基因型。基于此，运用单管多重PCR 技术在同一体系中加入多对互补引物，可检测出多种序列缺失型突变，包括-SEA、-THAI、-α4.2等。邓宇运等[10]对缺口PCR 在地中海贫血中的诊断价值进行了探究，其结果显示，缺口PCR 对α-地中海贫血具有较高的诊断准确率、灵敏度及特异度，且操作简单、快速，适用于缺失型α-地中海贫血的分子筛查及基因诊断中。

2.2.3 等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交（ASO）ASO 仅适用于已知基因突变的检测，其探针为20 bp左右长度的核苷酸，共包括2 种，一种与正常基因序列一致，仅可与正常基因序列杂交；另一种则与突变基因序列一致，仅可与突变基因序列杂交，由此区分碱基突变的基因。该技术可与PCR 结合，在突变点基因片段的体外扩增基础上，应用ASO 探针作点杂交，具有较高的灵敏度与精确度，但单次杂交仅可检测一种突变，且对DNA 数量及纯度具有较高要求[11]。

2.2.4 反向点杂交（RDB）RDB 的检测机制与ASO的原理基本相同，不同之处在于固定靶DNA 被膜上固定探针所替代，利用多种特异性探针中膜条与扩增靶序列的杂交，增加单次杂交可检测的突变类型，改变了传统杂交法仅可检测一种突变的操作模式。该技术检测时间短、检测成本低，在基层实验室的基因筛查及诊断中也具有较高的适用性。肖奇志等[12]对不同原理PCR 法在地中海贫血产前诊断中的可行性进行了验证，其结果显示，单管多重PCR 法联合RDB 的检测灵敏度较高，可准确检出常见非缺失α-地中海贫血突变类型；同时还可对单管多重PCR法的检测结果进行验证，在地贫产前诊断中具有较高的可行性，且可作为质量控制的替代方式，用以保证产前诊断的准确性，值得临床遗传诊断实验室的应用。

2.2.5 多重连接探针扩增技术（MLPA）MLPA 技术是在多重扩增探针杂交（MAPH）基础上改进而来，该方式可通过与样本DNA 杂交，被连接酶连接的探针进行扩增，随后依据其靶序列扩增产物量进行定量分析，是针对待测核酸中靶序列进行定性、定量检测的新技术，可检出目的序列内的全部基因缺陷[13]。但MLPA 操作相对繁琐，且检验条件要求高，不适用于大规模检测，可作为当前地贫基因缺失检测的补充方式。

2.2.6 基因芯片法 基因芯片法是20 世纪90 年代中期以来影响最为深远的科研进展之一，该技术是利用2 种不同荧光染料标记的靶序列与同一基因芯片进行杂交，通过不同颜色的荧光信号强度反映出基因表达的变化[14]。此外，基因芯片法可将大量探针同时固定于支持物上，因此可一次性检测大量生物分子，有效弥补了传统检测方式检测项目单一、低通量、费用昂贵等弊端，具有敏感、高效、平行化及自动化等应用优势。

2.2.7 DNA 测序技术 DNA 测序是基因分析的最精确方式，现已成为分析点突变的金标准。第一代DNA 测序技术由最初的化学降解法发展至荧光自动测序，开启了DNA 测序的自动化时代。而第二代测序技术在以上基础上实现了高通量测序，可一次性对几十万甚至几百万条DNA 进行序列测序，不仅高效、精确，还可检测出新型突变类型[15]。目前，第三代测序技术也应运而生，其测序平台主要包括Helicos Biosciences 公司的tSMSTM（truesinglemolecular sequencing）平台及美国Pacific Bioscies 公司的SMRT（single molecule real time）平台等。现随着国内科研实力及经济实力的快速提升，DNA 测序也由科研向医疗检测应用进行转变，对α 及β 地中海贫血基因突变的诊断具有重要意义。

2.2.8 其他 荧光实时定量PCR（RQ-PCR）、PCR-限制性片段长度多态性连锁分析（PCR-RFLP）、扩增不应突变系统（ARMS）、单链构向多态性PCR（PCR-SSCP）以及变性梯度凝胶电泳（DGGE）等均是地中海贫血突变基因的常用检测方式，其应用价值各异，临床需基于其可行性选择应用。

2.3 分子生物学治疗及应用

2.3.1 减少无效红细胞生成 无效红细胞生成是地中海贫血的重要病理生理机制，多与珠蛋白基因片段缺失或珠蛋白合成肽链失衡等原因有关。珠蛋白基因表达受限可引起珠蛋白肽链过剩，进而无法形成稳定的血红蛋白四聚体，易导致氧化沉淀形成的包涵体沉积于红细胞膜上，致使红细胞变形能力下降，红细胞寿命缩短，引起大量无效红细胞生成，最终导致溶血性贫血的发生。因此，减少无效红细胞生成是地中海贫血的重要治疗方式。①重组人促红细胞生成素（rHuEPO）：促红细胞生成素（EPO）是肾脏缺氧时释放的糖蛋白激素，可刺激骨髓中红系祖细胞的生长与分化，同时防止其凋亡。研究证实[16，17]，rHuEPO 可刺激血红蛋白F（HbF）的合成，以此增强红细胞生成，现已被视为地中海贫血病例输血治疗的安全替代方式，在脾切除以及初始HbF＞40%或低EPO 患者中可发挥重要作用，但对于严重的地中海贫血患者，尚需大规模的临床试验进行评估与验证；②JAK2 抑制剂：抑制JAK2/STAT5 途径对EPO 过度刺激的负面影响一直是治疗地中海贫血的重要研究方向，其中JAK2 是EPO 的唯一信号转导物，可引起信号转导、转录激活因子以及平行信号通路的激活，促使红系祖细胞的增殖与分化。基于此，JAK2抑制药物的应用将有利于地中海贫血患者的治疗。据相关研究显示[18]，JAK2 抑制剂可有效改善无效红细胞的生成，同时逆转脾肿大。目前，鲁索利替尼是美国FDA 批准的首批JAK2 抑制剂药之一，该药物的应用有助于减轻重型地中海贫血患者的输血负担，缓解其脾肿大及无效红细胞生成等状况，但其安全性及耐受性尚在研究中[19]；③激活素抑制剂：激活素抑制剂可影响红细胞生成晚期，对于无效红细胞生成引起的贫血疾病中具有一定治疗作用。目前，临床针对激活素受体-Ⅱ（ActRIIB 或ActRIIA）开发了2 种药物，即Luspatercept（罗特西普）与Sotatercept（索特西普），此2 种药物均是结合转化生长因子-β（TGF-β)家族配体的重组化合物，可作为激活素ⅡA型与ⅡB型的修饰受体，与人免疫球蛋白IgG1-Fc 片段融合，进而减轻下游信号传导的抑制作用，用于无效红细胞相关病症的治疗。相关研究指出[20]，该药对贫血的改善效果好，且耐受性良好，可减少患者的输血负荷，但针对患者可接受的活性剂量还需在后续研究的进一步观察；④Foxo3 诱导剂：Foxo3 可于红细胞生成的早期阶段上调抗氧化酶，以此保护细胞免受氧化应激损害，在减少无效红细胞生成的过程中具有重要作用。同时，Foxo3 的激活可促进红细胞成熟，诱导HbF 的红细胞表达，进而缓解贫血状况，因此，Foxo3 诱导剂的应用可有效改善地中海贫血的病情进展。二甲双胍作为二型糖尿病的常用治疗药物，同时可作为Foxo3 诱导剂，激活Foxo3 促进HbF 的红细胞表达，有利于贫血症状的减轻[21]。Camaschella C 等[22]对二甲双胍在镰状细胞性贫血及非依赖性输血地中海贫血中的治疗作用进行了研究试验，结果证实，二甲双胍可增加红细胞祖细胞中Foxo3 的活性，对HbF 的红细胞表达具有积极的改善作用。但以上试验尚处于临床前研究阶段，其应用有效性及安全性待进一步评估观察。

2.3.2 铁螯合剂 自发性溶血及频繁的输血均可导致铁元素在体内的过量沉积，进而引起心脏、肝脏以及内分泌系统的损害。因此，针对铁过载进行适当的调节治疗，是减轻其疾病损害的重要方式[23，24]，现多以铁转运蛋白及相关分子的调控为主要研究方向。①铁调素：铁调素是体内铁代谢调节的重要激素，其生物活性形式是由25 个小分子氨基酸多肽组成，可通过血液循环发挥作用，但无效红细胞生成及组织缺氧可抑制铁调素的合成与分泌，导致其体内循环降低，引起铁储存过多造成铁过载。因此，调节体内铁调素水平是减少地中海贫血铁超负荷的重要方向[25]。Casu C 等[26]研究指出，Mini-hepcidins等微量铁调素的使用可显著改善小鼠无效红细胞生成、铁超负荷及贫血状态，具有确切的治疗效果。Aghajan M 等[27]的研究显示，抑制TMPRSS6 基因可减轻其对内源性铁调素合成的干扰，改善贫血并减少铁负荷，逆转脾肿大，对非输血依赖性地中海贫血具有积极的治疗作用；②肠道缺氧诱导因子-2α（HIF2alpha）：铁转运蛋白可将铁从肠细胞转入血液循环，而HIF2alpha 则是调节该过程的关键因子，对血液中铁含量的调节具有重要作用。Anderson ER等[28]研究指出，在地中海贫血小鼠模型中，HIF2alpha 可于发病早期被激活，由此可引起铁积累，因此，破坏HIF2alpha 信号是纠正地中海贫血铁超负荷的重要研究方向，现已成为该病治疗的研究热点之一。

2.3.3 基因治疗 依据其分子机制，地中海贫血的基因治疗可通过珠蛋白基因的修复或重新激活，诱导HbF 增加，以此促进珠蛋白肽链比例的平衡，改善红细胞生成，达到治疗目的[29]。其中应用自体干细胞的基因治疗可作为造血干细胞移植的改良形式，将造血干细胞与祖细胞分离后，利用慢病毒载体将外源性珠蛋白基因整合至宿主细胞基因组中，随后将修饰细胞重新填充造血，以此纠正蛋白肽链比例，调节红细胞生成。此外，还有依赖于靶向基因编辑的替代方式，通过人造血干细胞相关珠蛋白基因的编辑，促使其分化为成熟红细胞，以此调节肽链中的珠蛋白平衡，改善病理状况[30]。但造血干细胞存在核酸酶，其靶向基因传递方式在临床的适用性较为有限，同时，在应用基因编辑治疗时，需充分明确靶核酸酶的遗传毒性，以此不断改进并完善，用于地中海贫血的治疗[31]。

3 总结

近年来，地中海贫血的诊治研究取得了巨大进步，其疾病诊断多以实验室血细胞检查及基因诊断为主，而治疗方案则主要为输血治疗、去铁治疗、造血干细胞移植以及脾切除等方式。在此基础上，分子生物学技术的发展为该病的诊断与治疗带来了新的研究方向，随着多种分子生物学诊治方式的相继出现，部分药理学或遗传学的新治疗靶点也逐渐被证实，但其应用大多处于研究状态，发展潜力尚有待明确，临床需在此基础上不断完善，以促进该病诊疗技术的不断提升。