活性氧与放射性皮肤损伤的研究进展

蔡卫超，曹卫红

(浙江省台州医院整形美容科,浙江 台州 317000)

放射性物质在我们的工作及生活中的应用越来越多，涵盖了工业、医学、科学研究等多个领域。与此同时，放射性皮肤损伤也受到了广泛的关注。放射性物质包含α、β、γ射线及中子等，不同剂量的放射性物质可对皮肤造成不同程度的损伤。而在临床工作中，有研究[1]显示约87%～96%的放疗患者会出现皮肤红斑等放射性皮肤损伤反应，其中放射性溃疡发生率为10%～15%。近年来，随着皮肤恶性肿瘤术后放疗的普及、外照射和放射性粒子内照射治疗逐步成为治疗规范，这些都使得放射性皮肤损伤成为临床常见病和多发病之一[2]。不同剂量的α、β、γ射线及中子对皮肤的损伤不全相似，其机理也不完全相同，但是皮肤损伤的表现形式相近。根据皮肤损伤的临床表现不同，我们将其分为轻度(Ⅰ度反应)、中度(Ⅱ度反应)及重度(Ⅲ度反应)。Ⅰ度反应表现形式主要为红斑、烧灼及刺痒感；Ⅱ度反应主要表现为高度充血、水肿及水疱形成；Ⅲ度反应会出现皮肤溃疡、坏死，并迁延不愈[3]。而针对放射性皮肤损伤，尤其是中重度以上的损伤，一直是临床治疗及基础研究中的重点及难点，因此对其分子机制及生理生化机理的研究显得尤为重要。

活性氧是放射性皮肤损伤生理生化过程中重要信号分子之一，参与了应激、损伤、修复的全过程[4]。机体受到意外照射或在接受放射治疗时会引起放射性皮肤损伤，最先皮肤组织内水发生离解产生以氧自由基为代表的活性氧(Reactive oxygen species (ROS))，其次化学反应及生物学反应产生的活性氧参与了长期的放射性损伤与修复过程。活性氧通过各类信号通路调控多个生理学过程，包括细胞凋亡与自噬、蛋白合成及氧化、脂质代谢、DNA损伤、炎症反应及旁观者效应等。本研究对皮肤接受放射性物质刺激后ROS的产生、其介导放射性皮肤损伤的机制、调控ROS降低放射性皮肤损伤等方面进行综述，进一步探讨ROS生物研究及临床治疗前景。

1 活性氧的产生

活性氧是一类氧的单电子还原产物。在氧分子中加入一个单一电子，就会形成超氧阴离子；加上另一个电子产生过氧化氢；加入第三个电子，形成羟基自由基。超氧阴离子是皮肤组织内氧自由基的主要类型，过氧化氢是氧自由基的主要前体[5]。生理状态下，呼吸过程会产生少量的氧自由基，氧自由基的产生与代谢存在平衡。放射性皮肤损伤后，早期大量活性氧的产生主要由线粒体呼吸链合成。当放射性物质刺激后，线粒体外膜被破坏、膜电势坍塌、电子传递链被干扰。泛醌参与的电子交互过程易发生电子的丢失，直接提高了活性氧的形成率[6]。

一方面，辐射导致的基因突变与活性氧的生成存在一定的正反馈调节途径。线粒体活性氧(mtROS)的产生以及辐射可以直接损伤线粒体DNA(mtDNA)，包括mtDNA的突变与mtDNA的复制数量大量减少。而mtDNA的突变与缺失干预线粒体外NADH的氧化还原偶联，使α-酮戊二酸脱氢酶产生ROS[7]。

另一方面，辐射介导各种生理生化反应也影响着ROS的水平。辐射致细胞内受体及分子相互作用，激活胞内信号通路，通过上调应激反应基因大量表达或下调ROS清除蛋白表达调节ROS水平。例如ROS活化促炎因子并激活炎症反应，介导TNF依赖Rac上调LTB4诱导ROS的产生[8]；辐射破坏BH4，导致一氧化氮合酶解偶联，加剧辐射诱导ROS产生[9]；辐射导致ROS产生，激活Nrf2蛋白并核内累积，通过上调Klf9抑制硫氧还蛋白还原酶2(ROS清除剂的一种)导致ROS暴发[10]。当然活性氧的产生也离不开辐射后的组织损伤与先天的免疫应答[5]。除此之外，在长期的组织修复过程中，活化的白细胞和巨噬细胞、促炎因子刺激的成纤维细胞、组织氧化引起的血管损伤等均会产生损伤性ROS。ROS亦能通过代谢途径产生更多的ROS。ROS对脂质、蛋白、线粒体及DNA的损伤能使细胞产生更多的ROS[11]。在心肌组织中，有研究表明存在ROS-p38 MAPK-NADPH-ROS正反馈回路，使得ROS能够快速启动心脏氧化损伤过程[12]。机体受到意外照射或在接受放射治疗后，长期存在的自由基、活性氧会导致皮肤辐射暴露后的渐进性损伤，从而长期损害基质干细胞的恢复和组织修复[4]。因此，活性氧与放射性皮肤损伤修复密切相关，这可能也是放射性皮肤损伤迁延不愈的重要原因之一。

2 活性氧调控机制

受到放射性物质刺激后，皮肤出现长周期的病理学改变，主要原因有以下三点：(1)成熟功能细胞的凋亡与自噬；(2)皮肤基底层与真皮层中干细胞及祖细胞的丢失；(3)体液间多细胞进行相互作用。

2.1 成熟功能细胞的凋亡与自噬

一方面，ROS精密地参与并调控细胞凋亡途径。转录组学及基因组学分析显示，辐射损伤后，BM细胞中253个基因被调控，而其影响的生物学功能受p38 mapk凋亡途径调控[13]。而内质网应激中，ROS亦通过MAPK相关通路调节蛋白转录参与多种生物学功能。ROS可激活MAPK- JNK通路形成正向自我调控环干预脂质代谢[14-15]。而脂质过氧化产物丙二醛(MDA)数量的增加，可以改变细胞膜的通透性，并解偶联线粒体中的氧化磷酸化，诱导细胞凋亡[16]。ROS通过激活MARK-p38通路抑制睾酮等生物合成。而睾酮能支持细胞氧化应激损伤，并抑制细胞凋亡[17]。ROS通过MARK-ERK通路介导c-fos及c-jun转录活化，形成异源二聚体AP-1，控制细胞凋亡[15]；ROS亦可通过上调TP53、HIF-1 H 、Nrf2 、SP1 等蛋白实现胞内调控。尤其是TP53蛋白，作为其中一种细胞凋亡的启动因子，ROS对其mRNA水平的稳定性产生极大的影响[15]。ROS亦可介导线粒体释放细胞色素C及钙离子或通过INOS-NO途径激活 caspase产生级联效应，干预细胞凋亡[18]。

另一方面，细胞自噬也与辐射产生大量的ROS密切相关。自噬是一种进化保守的、不可或缺的、溶酶体介导的降解过程。辐射刺激后细胞内酸性空泡大量形成，表明自噬活性增强[19]。诱导细胞自噬也与辐射造成的ROS依赖性损伤息息相关。辐射暴露过程中，含多个转录因子的iNOS启动子被激活，如核因子iB (NF-iB)和kruppel样因子6 (KLF6)，导致NO产生增加，诱导蛋白硝化介导的自噬诱导[20]。Yuan等人发现电离辐射后细胞自噬能力显著增强，表现为酸性囊泡细胞器形成增多，LC3II表达增加，p62表达降低,而用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸预处理可显著抑制细胞自噬[21]。Wang等人发现在ESCC细胞中，I125通过激活ROS诱导细胞凋亡与保护性自噬[22]。在辐射过程中，ROS产生并诱导内质网应激,一方面UPR过程中eIF2a(真核起始因子2a)被PERK(一种eIF2a激酶)磷酸化，激活Atg4介导LC3I向LC3II转化，而其他蛋白合成被关闭，最终导致自噬诱导[23]；另一方面,ROS通过负调控AKT/TSC/mTOR通路水平参与诱导自噬:ROS通过内质网应激上调P53，参与调控调节自噬调制器(DRAM)、ULK1/2、sestrin1/2和bnip3，调节溶酶体蛋白DRAM1和ULK1/2与Atg13和FIP200相互作用，或通过 Sestrin1和2激活AMPK和TSC1/2复合物导致mTORC1失活，激活细胞自噬[23-24]。在ROS诱导自噬的过程中，钙离子在其中也起着关键作用。研究表明，ROS通过升高钙离子信号，以CaMKK和ampk依赖方式抑制mTOR活性并增加AMP/ATP比值、激活AMPK信号，介导细胞自噬诱导[25]。Mol抗凋亡Bcl-2蛋白是内质网水平Ca2+诱导的细胞自噬的关键调节因子，在ER产生过量ROS靶向方式诱导下，Bcl-2过表达抑制线粒体IP3Rs-Bcl-2-Beclin-1信号通路，降低Ca2+诱导的自噬[26]。ROS诱导的DNA损伤与细胞自噬亦息息相关。ROS造成DNA损伤，使ALFY从细胞核被挤压到细胞质，并以质核穿梭的方式与p62小体相互作用，诱导自噬[27]。ROS可直接影响线粒体及核内DNA的突变与复制，也可通过影响细胞代谢或者相关信号通路诱导DNA损伤。有报道称，辐射产生的ROS导致内质网容量损坏，抑制RPA-DNA结合蛋白合成，直接损伤DNA功能[28]；氧化应激可通过抑制与ulk1相互作用的蛋白FIP200引起DNA损伤反应(DDR)[29]。

综上所述，ROS在细胞凋亡与自噬的调节过程中起到了重要且不可替代的作用。ROS、内质网应激、钙离子信号改变在诱导细胞自噬与凋亡中起着级联作用[30]。根据氧化还原密码第二原则，即“蛋白组的氧化还原在动力学上由硫开关联系的 NAD 和 NADP系统调控”，ROS在其中起到了重要作用[31]。ROS导致氧化还原平衡被破坏，蛋白质被氧化，酶、膜转运蛋白、调节蛋白的功能丧失。蛋白的积聚与ROS影响蛋白(包括蛋白水解酶)转录、翻译水平，及影响蛋白水解酶活性有关[32]。ROS造成的内质网应激，可在Caspase家族蛋白协助下，通过UPR途径减缓损伤，而长期ROS的压迫，氧化蛋白在细胞内积聚，激活ERS系统，介导细胞凋亡与自噬[33]。ROS诱导的细胞质Ca2+内流升高，起源于内质网或细胞外环境，接着被线粒体缓冲。然而，持续升高的钙离子超过线粒体的缓冲能力而在细胞质中积累，介导细胞凋亡与自噬诱导[34]。

2.2 皮肤基底层与真皮层中干细胞及祖细胞的丢失

研究表明，干细胞的ROS水平远低于其较成熟的后代，ROS的差异对于维持干细胞功能至关重要[35]。而辐射诱导的高浓度ROS无论从功能上或是数量上均造成了皮肤干细胞及祖细胞的丢失，不足以分化成足够的功能性细胞以维持皮肤辐射后生理需求。Manda等人提出，无论是高剂量还是低剂量的任何种类辐射都会影响干细胞的增殖、周期与衰老诱导[36]。放射性刺激后干细胞迅速受损，增殖能力减弱；3天后细胞凋亡率能达到正常干细胞的3倍；而辐射导致的干细胞DNA损伤可以维持数月。辐射对干细胞及成熟细胞生理功能的影响可能存在极其相似的分子学过程，ROS的介导与其密不可分。电离辐射刺激会影响干细胞的凋亡率和分化能力，从而降低成熟细胞的生成率[37]。研究表明辐射通过改变ROS水平干预干细胞的增殖、凋亡及分布，其损伤机制可能与PPAR、P53、TNF水平有关[38]。Kumar等人[39]表明重离子辐射通过ROS的累积与DNA损伤的不断增加影响干细胞中SASP的表达调控细胞衰老。Rodrigues-Moreira等人[40]发现辐射能对干细胞造成长期不利的影响，其机制为低剂量辐射持续刺激产生的活性氧通过Keap1/Nrf2抗氧化途径激活造血干细胞自噬。

2.3 体液间多细胞的相互作用

体液间细胞相互作用方式不外乎这三种:(1)直接接触；(2)借助信号分子间接接触；(3)相邻细胞借助特殊通道进行接触。ROS作为信号分子的一种，在细胞间相互影响的过程中，起到一个信号分子的作用。而其促进细胞间直接接触或者特殊通道打开的相关研究甚少。因此ROS通过借助信号分子间接接触来干预辐射损伤。辐射损伤后ROS主要以下两方面干预皮肤损伤:(1)炎症微环境的改变；(2)旁效应。

研究表明，辐射暴露显著增加的过氧化物与免疫改变呈辐射剂量依赖：辐射暴露后，人体内过氧化物、IL-6、IL-1a、MIP-1a显著升高，其机制离不开辐射产生的ROS诱导的炎症反应[41]。长期慢性的炎症反应疾病进展中，ROS充当着核心角色，其不单是一种炎症信号分子，也是一种炎症介质[15]。一方面，辐射损伤后皮肤组织内产生的ROS作为信号分子促进炎症相关因子活化并激活炎症反应。细胞因子和趋化因子的级联反应及辐射强刺激是导致放射性皮肤损伤慢性病程及严重损伤的重要原因。在皮肤细胞反应中，IL-1、IL-6、TNF-a、TGF-b等细胞因子尤为重要。研究表明ROS可参与激活NF-KB、p38 MAPK信号通路，从而刺激多种炎症因子表达，包括IL-1b、IL-6、硫氧还蛋白、超氧化物歧化酶等[42]。TGF-β与ROS之间存在着一定的反馈调节：Escin 1α发挥生物学效应的过程中依靠ROS依赖的HIF-1α/TGF-β/MMPs信号通路；TGF-β的激活可以增加mtROS水平，抑制TGF-β转导亦能降低mtROS而降低DNA损伤[43-44]。而mtROS亦可作用于TNF-1受体参与炎症信号转导[45]。ROS通过MAPK信号通路调节细胞内的氧化应激：ROS的产生导致p38 mapk去磷酸化，磷酸化p38 mapk和RAC2通过相互反馈调节途径GO期细胞辐射损伤[46]。

另一方面,免疫细胞与ROS息息相关。免疫细胞通过ROS的合成发挥抗炎及组织修复的作用，其NADPH氧化酶活性及其产生的ROS是宿主防御的关键[5,47]。在NADPH氧化酶的作用下，巨噬细胞和中性粒细胞的激活导致大量超氧阴离子自由基及其衍生物释放活性氧[48]。ROS亦影响巨噬细胞的生物学功能。吞噬性NADPH氧化酶(Nox2)来源于巨噬细胞，其作为一种新型胞内ROS通过MEK1/ERK途径促进巨噬细胞死亡[49]。有研究表明：血管扩张突变激酶(ATM)的活化是电离辐射诱导巨噬细胞活化所必需的；ROS的产生是ATM激活的上游环节；ROS的破坏会直接损伤巨噬细胞促炎机制的激活[50]。ROS亦参与双向ERK激活影响巨噬细胞分化[49]。与此同时，ROS干预免疫细胞的生理学功能：促进巨噬细胞释放HMG1等蛋白调节白细胞黏附分子表达；引导中性粒细胞迁移；激活免疫细胞氧化还原信号感受器等[14]。

辐射诱导的旁效应(RIBE)已成为放射学的新教条，其介导了DNA损伤、细胞杀伤、未辐射细胞的基因表达及基因突变等生物学变化。放射性皮肤损伤中，损伤范围大、深度广、病程长、迁延不愈等均与RIBE息息相关。ROS作为一种信号因子，亦可通过RIBE途径调节相应信号通路发挥其生物学功能[51]。研究表明，RIBE效应导致未辐射的MRC-5细胞内ROS显著增加，介导线粒体活化[52]；辐射诱导的基因突变可能与线粒体中产生活性氧介导的RIBE有关[53]。在表观遗传学上被DNA甲基化和组蛋白修饰沉默多聚P35S:GUS通过RIBE转录激活；活性氧(ROS)清除剂二甲基亚砜(DMSO)可显著抑制转录激活，表明ROS在RIBE介导的表观遗传变化中起关键作用[54]。

3 靶向调控ROS相关通路降低放射性皮肤损伤

临床治疗中，目前针对放射性皮肤损伤的药物仍不明确，但是抗氧化治疗的临床使用和科研探究从未中断。传统意义上抗氧化剂的选择包括以下几类：(1)MnSOD为代表的超氧化物歧化酶家族；(2)以Tempol为代表的N2O类化合物及衍生物；(3)依布硒为代表的小分子化合物；(4)大豆异黄酮为代表的天然化合物[55]。近年来，对抗氧化物在放射性损伤的临床应用及基础研究亦层出不穷。

3.1 活性氧清除剂

Yuan等人[21]指出活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸能显著抑制辐射刺激后的细胞毒性和细胞自噬；小剂量长期辐射刺激后线粒体产生的ROS对细胞周期AKT-/cyclind1信号通路有干扰作用，而抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸和线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO能有效减轻这种辐射损伤[56]。Mn3O4纳米粒子(NPs)、CeO2纳米酶等能有效的清除剂体内ROS水平减轻辐射损伤[57]。

3.2 小分子化合物

18β-甘草次酸(18β-GA)通过降低巨噬细胞内ROS在放射性皮肤损伤中发挥抗炎抗氧化作用[42]。二氢烟酰胺(Mito-N)能有效利用线粒体膜电位变化清除累积的ROS减轻辐射对电子传递链的损伤[58]。未改性的水合c-c富勒烯分子(CUHFM)在电离辐射作用下能减少水中ROS和DNA中8-氧代胍的生成，从而降低辐照小鼠DNA与染色体断裂，有效降低辐射损伤[59]。

3.3 天然合成物

迷迭香酸衍生物(Mito-RA)可以通过阻止ROS在线粒体中积累，减轻辐射诱导的氧化损伤[60]。香兰素衍生物(VND3207)通过DNA-PKcs途径有效发挥辐射后的抗氧化及抗突变作用[61]。

4 展望

ROS在放射性皮肤损伤的发展中起着重要作用，包括基础研究、临床预防及治疗等各个方面。对该病程中ROS的产生、反应机制、靶向治疗等方面进行研究，有助于我们更好地了解正常皮肤细胞、相关干细胞及组细胞、炎症细胞之间的相互作用机制，帮助我们正确处理这些过程中ROS带来的不良影响，并为治疗放射性皮肤损伤寻找新靶点。