基于纳米材料的细胞释放生物信号分子电化学传感器的研究进展

王彩霞， 王俊怡， 黎夏彤， 舒 婷， 王小波， 王 诗*

(湖北科技学院药学院，湖北咸宁 437100)

1 引言

生命体结构和功能的基本单元为细胞，细胞则通过释放各种信号分子进行胞间信息传导交流，进而实现对机体整体功能调节控制，如果信号分子在生命系统中异常表达会导致多种疾病。NO是由NO合酶产生的亲脂性、高度扩散性的气体信号分子[1]，高水平NO可造成细胞毒性与亚硝基应激，与脑缺血、脑部感染和神经退行性疾病的神经元死亡有关[2]。H2S不仅是血管调节分子，还是大脑内神经递质和神经调质信号分子，参与学习、记忆和疼觉调节，H2S的异常产生和代谢与缺血性中风、阿尔兹海默症、帕金森氏病和癫痫发作的机制相关[3]。H2O2作为信使分子，通过细胞和组织扩散可引发细胞形状改变、细胞增殖和免疫细胞增殖等细胞效应[4]，涉及多种退行性改变或氧化应激有关的疾病[5]。因此，对细胞释放的生物信号分子进行准确、实时和动态监测，对认识胞间信息交流机制、分析正常生理过程，以及揭示疾病的分子机制具有重要意义。由于细胞释放的各种信号分子浓度较低，半衰期短[6]，检测必须具有高灵敏度、高选择性及快速响应能力的特点。

近年来，电化学分析方法发展迅速，如电化学阵列传感器、微电极电化学检测，以及活体、微区或单细胞分析等技术已被用于实时监测细胞释放的生物信号分子。电化学阵列传感器以阵列中每根电极所产生的电化学信号为检测信号，具有高通量、快速和高选择性等特性[7]。随着微电子技术的应用，传感器阵列技术的发展可以减少样品体积降至亚微升水平，但其对于细胞特异性较低[8]。活体电化学分析能够更加真实直接地反映各种生理病理过程中对外界刺激的反应[9]，但生命体系复杂性，分子间相互作用多样性使活体电化学传感器面临严峻挑战。单细胞分析技术精密度高，但是难以实现高通量[10]。因此，利用合适的检测手段实现细胞释放生物信号分子的实时、动态监测仍然充满挑战。电化学分析中未修饰电极容易受到外界或者内部干扰，因此研究者们利用纳米材料固定细胞，用以保持细胞的生物活性并提高电化学响应信号。因此，寻找具有易于制备、低成本、高稳定性等优点的纳米材料一直是研究的重点[11]，如：纳米金属材料，包括金属纳米颗粒(Au、Pt、Ag、Cu等)[12]、金属氧化物(Cu2O等)[13]，具有高比表面积、高电子迁移率、热稳定性和机械强度等特性[14]；纳米非金属材料如石墨烯[15]、碳纳米管[16]、碳纳米纤维和碳量子点[17]等，具有较大比表面积、高导电性，可再生性和结构多样化等特点[18]；纳米复合材料如金属材料或非金属材料与碳材料复合，复合后电化学反应活性增强，材料的力学性能得到显著提升，具有极高的可塑性和强度[19]，可更准确快速的实时监测细胞释放的生物信号分子。

本文通过总结近年基于纳米材料的电化学传感器用于检测细胞释放的生物信号分子的研究进展，为未来深入研究细胞传感器提供参考。

2 碳纳米材料

2.1 碳纳米管

碳纳米管(CNTs)是单层或多层石墨片围绕中心轴按一定的螺旋角卷曲而成的无缝纳米级管，具有优异的力学、电子、热力学等特性[20]。Bai等[16]利用碳点(CDs)修饰的多壁碳纳米管(MWNTs)提高传感器的电催化活性，用于实时检测从细胞中释放的H2O2。Du等[21]通过将单壁碳纳米管(SWNTs)和Nafion膜修饰到碳纤维微盘电极表面，用于单个人脐静脉内皮细胞NO释放的实时检测。Sahraoui等[22]将(APy)6[H2W12O40] 共价接枝到SWNTs-COOH表面，对H2O2的检测灵敏度提高了38.5倍。

2.2 石墨烯

石墨烯(Graphene,Gr)是一种具有单原子厚度的二维碳材料，sp2键合C原子紧密堆积在蜂窝晶格结构中，具有高导热性、化学柔韧性、优异的电子特性和机械强度[23]。Guo等[24]在芘丁酸功能化Gr表面共价结合RGD肽构建仿生膜供细胞附着生长。该仿生膜修饰传感器具有出色的选择性和稳定性，能够实时检测细胞释放的NO。Yusoff等[25]利用Gr修饰玻碳电极(GCE)，该修饰电极对NO的氧化表现出出色的电催化性能。Hu等[26]将3-氨基苯基硼酸(3-Aminophenylboronic acid，3-APBA)的仿生特性与Gr泡沫的电化学特性相结合，开发了一种3-APBA功能化的Gr泡沫网络，可用于实时监测从三维支架培养的细胞中释放的H2S。Devi等[27]也报道了一种9，10-苯醌系氧化Gr修饰的GCE，用于包含H2S在内的硫化物离子的电催化氧化分析。Manibalan等[28]利用氧化石墨烯(GO)膜修饰电极作为传感器，可以实时定量检测大肠杆菌内产生的H2S。

3 金属纳米材料

各种金属纳米粒子Cu、Ag、Ti等因其独特物理化学特性具有低毒、高表面积和易于表面功能化等特点，被广泛用于制造非酶型H2O2传感器。Qi等[29]开发了一种基于Fe3O4-Ag纳米材料的电化学传感器，可以在0.5 μmol/L～4.0 mmol/L的线性范围内检测H2O2。Kang等[30]在不添加表面活性剂的情况下，通过电沉积和电流置换反应，在Cu箔上合成树枝状纳米Ag-Cu，将其修饰在电极上进行H2O2检测，结果显示纳米Ag-Cu具有良好电还原活性。Yin等[31]采用在纳米多孔Au表面电沉积Pt纳米颗粒(Pt NPs)的方法修饰Au电极，由于Pt MPs对H2O2具有良好电催化活性，纳米多孔Au可增加有效表面积并促进电子转移能力，结果显示H2O2检测的线性范围为1.0×10-7～2.0×10-5mol/L。Karuppiah等[32]构建了基于Pd NPs和Nafion修饰的超高选择性和高灵敏的无酶型H2O2传感器。此外，PtW纳米晶体和MoS2纳米片结合形成的杂化纳米材料对H2O2的还原也具有良好的催化反应[33]。

过渡金属磷化物因其类金属特性表现出极好电催化还原活性。Li等[34]通过制备磷酸铜纳米线，首次实现了基于过渡金属磷化物材料的传感器。构建的这种传感器用于检测肿瘤细胞释放的H2O2，检测限达到 2 nmol/L。

电化学传感器检测细胞中释放的H2S鲜有报道。Zhao等[35]利用Au-Ag核壳-纳米粒修饰电极用于检测Hela细胞释放的H2S，其线性范围为0.1～500 nmol/L。

4 纳米复合材料

4.1 复合金属/碳材料

与单独的碳材料相比，复合金属/碳材料可以提供独特的特性[36]。各种Gr -金属纳米粒子已用于H2O2的检测，如Gr与Ag纳米粒[37]、Pt纳米粒[38]、Au纳米粒[39]等的结合使电化学传感器表现出优异电催化性能。Gr与金属氧化物结合而成的纳米复合材料用于H2O2检测也是热点之一。Fang等[40]基于Fe3O4-还原氧化石墨烯(RGO)纳米复合材料，制备了一种无酶型电化学传感器，并用于检测从Hela细胞释放的H2O2。

MnO2对H2O2有电催化活性[41]。Dong等[42]采用MnO2纳米线/RGO为柔性电极，检测巨噬细胞释放的H2O2，方法具有良好的稳定性、选择性和重现性。也有研究者合成羟基氧化钴纳米薄片组合在GO表面，表现出优异电化学性能，H2O2的检测限为0.01 μmol/L[43]。Wang等[44]将NiCo2O4-CoNiO2纳米材料嵌入Gr中，将该复合材料修饰电极用于检测从癌细胞中释放的H2O2，结果显示传感器表现出高灵敏度和低检测限(0.41 μmol/L)。

细胞释放的NO浓度低、半衰期短，因此监测细胞中NO含量需要传感器有足够的灵敏度和生物相容性。Liu等[45]利用Au纳米材料和CNTs的复合纳米材料，设计了一种可伸缩电化学传感器，该复合纳米材料不仅具有极好的细胞相容性，还具有出色的电化学性能。研究表明，Gr-Au纳米复合材料[46]、CeO2-RGO纳米复合材料[47]、Pt-Fe(Ⅲ)氧化物纳米复合材料[48]修饰的电化学传感器也对NO的检测表现出明显的电催化反应。Dou等[49]在氮掺杂石墨烯片上生长高度分散的Au纳米材料检测癌细胞中释放的NO。Xu等[50]合成的酞菁功能化的氮掺杂Gr纳米复合材料也表现出优异电催化活性，该复合材料修饰电极可以实时监测活细胞释放的NO。

复合金属材料/碳材料也广泛用于H2S的检测。Asif等[51]在导电CNTs支架上接CuMn层状双氢氧化物纳米片，形成独特的核-壳结构，因核-壳结构有大量表面活性部位和层状双氢氧化物优越的比表面积，对活细胞释放的H2S氧化表现出优秀的电催化活性。Shang等[52]设计了基于GO/亚甲基蓝/Ag纳米复合材料的电化学传感器用于检测生物样品中H2S，由于GO的良好吸附能力和树枝状Ag纳米结构，该电化学传感器具有高灵敏度、高选择性和良好的稳定性。

4.2 复合非金属/碳材料

Balamurugan等[53]将普鲁士蓝微立方体与Gr化CNTs混合，通过水热法形成纳米复合材料，用于修饰电极来实时追踪哺乳动物细胞释放的H2O2，结果显示该传感器具有响应速度快、检测限低的特点。Jiao等[54]利用聚二烯丙基二甲基氯化钠封端的RGO烯纳米片组成有效电极用于动态监测细胞内H2O2，线性范围为0.05 μmol/L～5.5 mmol/L，检测限为1.2 nmol/L。Zhang等[55]基于还原的血红蛋白和SWCNTs研制了一种高灵敏度生物传感器，用于检测从活细胞中释放的H2O2，研究表明所制备的传感器对H2O2检测表现出高的灵敏度、选择性和亲和性。

此外，将CNTs与聚合物如聚苯胺[56]、聚乙醇烯[57]、聚吡咯[58]等形成CNTs/聚合物复合材料也显示出良好电催化反应。量子点(Quantum Dots，QDs)具有良好的细胞相容性、低细胞毒性的特点[59]也成为近年来研究热点。Zhang等[60]设计了新型N、S掺杂的QDs/Gr杂化纳米片，可催化Raw 264.7细胞释放的H2O2的还原反应。Cai等[61]发现Co3O4QDs-胺化碳纳米管(ACNTs)对H2O2还原的电催化效应远高于Co3O4纳米颗粒-ACNTs。

复合非金属材料/碳材料也可用作催化NO的电催化媒介。Zheng等[62]利用偶氮胭脂红B功能化的MWCNTs设计了一种电化学传感器，该传感器用于检测鼠肝脏细胞中释放的NO，结果表明在2.2×10-7～1.2×10-4mol/L范围内，氧化电流随NO浓度呈线性增加，表现出高的稳定性、灵敏度和选择性。

5 结语

本文综述了基于碳、金属等纳米材料的电化学传感器检测细胞释放的NO、H2S及H2O2。纳米材料的纳米级尺寸可以增加检测灵敏度；高导电性加快了电子转移能力；生物相容性为检测细胞释放的各种信号分子提供了更多的可能性。但纳米材料也存在一些问题，例如机制不确定，合成制备较复杂影响实验结果的稳定性与重现性等。因此，发展具有更出色催化活性并安全可靠的新型纳米材料势在必行。

细胞分泌的各种信号分子在机体整体调节中起至关重要作用，而检测各种信号分子的方法对正常生理过程及揭示疾病的分子机制具有重要意义。近年来，细胞电化学传感器迅速发展，在细胞的实时动态监测上已经得极大进步。然而不同疾病情况下细胞所呈现不同状态，利用细胞电化学传感器精确测定不同状态下细胞释放的信号分子仍具有挑战。细胞电化学传感器领域还有待于人们更加系统而深入的研究，若能连续监测不同生理病理条件下细胞所释放的生物信号分子，将更有利于为临床分析提供依据。