抗菌止血水凝胶医用敷料的制备及其性能研究

马 莉，仇威王，吴德群，2

(1.东华大学 纺织学院，上海 201620；2.东华大学 纺织面料技术教育部重点实验室，上海 201620)

0 引言

医用伤口敷料旨在提供一个合适的环境促进伤口愈合，并预防细菌感染。因此，传统敷料如纱布或者棉团已逐步被新型医用敷料占据市场。目前，水胶体、支架和水凝胶等促湿材料比传统干燥医用材料更受欢迎[1]。而水凝胶作为新兴材料，本身质地柔软，具有极强的保水性和不黏连性，水凝胶材料具有多孔结构，可吸附大量的水，通过其水分交换活动帮助促进伤口愈合，并可提供相对冷却的环境，舒缓伤口疼痛，在伤口和敷料之间形成最佳环境[2]。

葡聚糖是一种高水溶性天然多糖，由细菌分泌。葡聚糖制备的水凝胶具有优异的生物相容性和生物降解性等特性[3]。通过修饰，葡聚糖可以功能化和交联，并应用于物质分离、药物输送和组织工程领域[4]。长链烷基季铵盐类抗菌剂是一种在织物品类中应用较广的抗菌剂。由于季铵盐带正电，细胞膜带负电，季铵盐与细菌细胞膜结合后细胞膜破裂，从而达到抗菌目的[5]，因此长链烷基季铵盐的良好的抗菌性能及抗菌持久性拥有广泛的市场。

本文以十六烷基二甲基乙基溴化铵和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-570)接枝棉织物制得改性抗菌棉织物，经过改性的葡聚糖水凝胶单体、抗菌胍盐、凝血酶、混合溶液浸泡在改性抗菌织物中，通过紫外光原位交联方式形成敷料，并研究了其抗菌性、止血性、溶胀性等一系列性能。该方法制备得到织物增强的多糖类水凝胶基敷料具有优良的吸液性、抗菌性和止血性，同时具有良好的机械性能及柔软性，能加快伤口愈合。

1 实验部分

1.1 原料

棉织物(平纹组织，克重为156 g/m2)，葡聚糖(Mw＝70000)购买于百灵威科技公司，甲基丙烯酸酐(MA)购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，N，N’-二甲基甲酰胺、二氯甲烷购买于上海凌峰公司，氯化锂、三乙胺、异丙醇、无水乙醇均购买于国药集团化学试剂有限公司，十六烷基二甲基乙基溴化铵、凝血酶购买于上海源叶生物科技有限公司，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌购买于南京便诊生物科技有限公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购买于上海酶联生物，琼脂购买于中国惠兴生化，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-570)、盐酸胍购买于上海皓鸿生物医药科技有限公司，2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(I2959)、1，6-己二胺购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

MS7-H550-S磁力搅拌器(上海亚荣)，Nicolet 6700型傅里叶红外光谱仪(美国赛默飞世尔)，Avance400型核磁共振氢谱仪(瑞士布鲁克)，FSTRO-10超纯水机(上海富诗特)，AL204电子天平(梅特勒-托利多集团)，ML-3500紫外线灯(上海峰志)，DZF-6050真空干燥箱(上海精宏)，S-4800型场发射扫描电子显微镜(日本日立)，LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安)，HWS-250HL型恒温培养空气摇床(上海贺德)，SPX-80B-II型生化培养箱(上海贺德)，DKZ系列电热恒温振荡水槽(上海一恒科技)，HD-650型超净台(苏州净化)，ALPHAL-2冷冻干燥机(德国克莱斯特)，YG(B)026G型电子织物强力机(温州大荣纺织仪器)。

1.3 持久抗菌棉织物的制备

1.3.1 改性棉织物得制备

先对棉织物进行了抗菌和不饱和双键改性，然后将水凝胶在棉织物表面原位聚合，通过化学交联和物理穿插交联作用与棉织物复合，制备织物增强多功能水凝胶敷料，以实现优良的抗菌和止血性能。

首先，称取充分干燥后的纯棉织物；将不同质量的十六烷基季铵盐、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-570)溶解于20 mL乙醇水溶液里(无水乙醇∶水＝1∶1)，加入稀盐酸调节溶液pH在5～6之间。将纯棉织物放入上述溶液中，室温下(25℃)反应12 h。反应完成后，超声清洗棉织物并水洗，充分除去未反应的单体，制备改性棉织物。改性棉织物的投料比如表1所示:

表1 改性棉织物的投料比

1.3.2 M-PHMG单体的合成

参考文献[6]，聚六亚甲基胍盐酸盐(PHMG)的制备方法为:在容器中加入14.5 g 1，6-己二胺与12 g盐酸胍，在N2保护下温度为120℃的条件中反应2 h，同时除去产生的NH3，接着在温度为180℃条件下反应6 h，然后将产物后放置于100℃的真空烘箱中烘干6 h，制备PHMG；改性聚六亚甲基胍盐酸盐(M-PHMG)的制备方法为:用量筒称量10 mL DMSO倒入容器中，并称取1.25 g PHMG与0.5 g甲基丙烯酸酐(MA)放入容器中，室温条件下在磁力搅拌台上搅拌均匀后加入0.5 g三乙胺，并在黑暗冰浴条件下反应24 h，最后使用二氯甲烷将产物萃取3～5次后置于真空烘箱中室温条件下烘干，得到M-PHMG，化学反应式如图1所示:

图1 M-PHMG的合成

1.3.3 Dex-MA单体的合成

在90℃高温条件下，将4 g葡聚糖溶解于100 mL氯化锂和N，N’-二甲基甲酰胺的混合溶液中(氯化锂含量为10 wt%)，通氮气溶解。待葡聚糖完全溶解后，溶液冷却至70℃，将0.36 g三乙胺催化剂加入到葡聚糖溶液中，磁力搅拌10 min，再加入5.5 g甲基丙烯酸酐在氮气的保护下反应10 h。反应混合物在冷异丙醇中沉淀析出，用异丙醇洗涤三到五次，沉淀、过滤、干燥，得到产物带有双键的葡聚糖(Dex-MA)单体。反应原理如图2所示:

图2 Dex-MA单体的合成

1.3.4 抗菌止血水凝胶以及织物增强水凝胶敷料的制备

将经过改性的葡聚糖单体溶于去离子水中，制备20 w/v%的改性的葡聚糖单体溶液，加入光引发剂(I2959)、不同质量的改性抗菌剂和凝血酶，通过紫外光原位交联方式形成水凝胶。具体投料比及紫外光照时间如下页表2所示。

水凝胶复合棉织物敷料制备方法按照表2相同配比在紫外光照射之前将充分干燥的改性棉织物裁剪成一定的大小后平铺，将改性后的抗菌织物浸泡在上述混合溶液中，使得每平方厘米织物沉积约0.1 mL的水凝胶。然后转移至紫外灯下，紫外光照10 min，引发自由基聚合，得到水凝胶复合棉织物。

表2 水凝胶的投料比

1.4 实验测试与性能分析

1.4.1 傅里叶变换红外光谱(FTIR)

为确认单体结构，将干燥后的样品放置于Nicolet 6700型傅里叶红外光谱仪的探头下测试，并记录范围为500 cm-1～4000 cm-1的光谱。

1.4.2 核磁共振氢谱(1H NMR)

将5 mg～8 mg样品溶解于装有氘代水的核磁管中，使用AVANCE400型核磁共振波谱仪进行测试，测试后确定单体中H的归属。

1.4.3 场发射扫描电子显微镜(SEM)

样品经过冷冻干燥后粘在附有有导电胶的样品台上，经喷金制样后采用S-4800型场发射扫描电子显微镜对样品表面形态进行测试，观察其表面形态。

1.4.4 溶胀性测试

秤取0.75 g经过冻干后的水凝胶样品放于PBS溶液中，此时样品质量记为m0，每隔一段时间取出，用滤纸将水凝胶表面的水擦干净，立即称取试样质量，将此质量记为m，按照以下公式(1)计算每个试样的溶胀倍数[7]:

1.4.5 定性抗菌性能实验

为探究样品是否具有抗菌性能，进行定性抗菌实验。首先将琼脂以及相关器皿灭菌处理，再在无菌培养皿中加入10 mL～15 mL灭过菌的琼脂培养基，然后将培养好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液稀释至1×104CFU/mL，取0.5 mL稀释后的菌液涂附在冷却凝固了的琼脂表面中，最后在涂覆了细菌的琼脂板中间放置直径为2.5 cm的织物样品，然后将其置于生化培养箱中培养24 h后取出揭开织物样品，观察与织物接触面的细菌繁殖状态。

1.4.6 定量抗菌性能实验

以GB/T 20944.3-2008为标准，将水凝胶敷料进行定量抗菌实验。在培养24 h后，将对照样锥形瓶内的活菌浓度记为Wt，将样品锥形瓶内的活菌浓度记为Qt[8]，计算试样的抑菌性(Y)公式如下(2):

1.4.7 止血性能测试

将40只ICR级6～8周小鼠(上海杰思捷实验动物有限公司提供)随机均分成4组，每组10只，雌雄各半。将所用敷料分为4组，第1组为改性织物CCT-4复合gel-6水凝胶敷料组，记为CCT-4-gel-6；第2组为改性织物CCT-4复合gel-7水凝胶敷料组，记为CCT-4-gel-7；第3组为改性织物CCT-4复合gel-8水凝胶敷料组，记为CCT-4-gel-8；第4组为改性织物CCT-4复合gel-9水凝胶敷料组，记为CCT-4-gel-9。实验中将小鼠用固定器固定，然后剪断距尾部3 cm左右位置的小鼠尾巴，待有血液流出后，分别将1～4组改性织物复合水凝胶敷料涂敷于小鼠断尾截面处，每10 s记录一次，直至不再有血液流出时记录完全止血时间。

2 结果与讨论

2.1 傅里叶变换红外光谱(FTIR)

Dex-MA的红外光谱结果如下页图3所示，在1718 cm-1处有一个(C＝O)的红外波段，在1657 cm-1(C＝C)和817 cm-1(C＝C-H)处的红外光谱带证实了Dex-MA中存在垂链乙烯基，证明了Dex-MA的成功合成。

图3 Dex-MA的红外光谱图

分析傅里叶变换红外光谱来确认PHMG的合成情况，如下页图4所示。位于3100 cm-1～3300 cm-1附近范围为(-N-H)的伸缩振动峰；位于2800 cm-1～2900 cm-1范围的峰为双甲基中(-C-H)的对称和反对称伸缩振动峰；位于1623 cm-1范围的峰为盐酸胍以及PHMG上(-C＝N)的伸缩振动峰，说明盐酸胍成功与1，6-己二胺发生了反应，生成PHMG。

图4 PHMG的红外光谱图

分析傅里叶变换红外光谱来确认M-PHMG的合成情况，如图5所示。位于1622 cm-1处的峰为PHMG以及M-PHMG上(-C＝N)的伸缩振动峰，没有明显观察到(-C＝C)的峰，推测是被1622 cm-1的峰所覆盖。

图5 M-PHMG的红外光谱图

2.2 核磁共振氢谱(1H NMR)

通过分析核磁共振氢谱(1H NMR)确认Dex-MA上各个H原子的归属，如图6所示，DEX-MA中乙烯基的存在进一步被1H NMR光谱证实。在双键区域有两个明显的a峰(5.71 ppm)和b峰和(6.11 ppm)，对应于双键附近的两个氢原子(-C＝CH2)，1.80 ppm位置处的c峰为甲基丙烯酸酯基团中甲基取代物(-CH3)上的氢。

图6 Dex-MA单体的1H NMR

通过分析核磁共振氢谱(1H NMR)确认MPHMG上各个H原子的归属，如图7所示。峰值在5.5 ppm～5.7 ppm处的a，b峰为双键(-C＝CH2)上两个氢原子，峰值位于1.75 ppm处的c峰为甲基取代物(-CH3)上的氢原子，说明M-PHMG被成功合成。

图7 M-PHMG单体的1H NMR

2.3 表面形貌分析

首先将水凝胶样品放置在PBS中在室温下溶胀平衡24 h，然后使用液氮作为低温剂，迅速将其冻结在冰点以下，切断截面部分，然后将样品容器转移到冷冻干燥机中冷冻干燥，直至所有水升华。然后将干燥后的样品经过喷金处理后使用导电胶粘在样品台上，对水凝胶样品进行SEM测试，结果如图8所示。由图可得，水凝胶内部横截面显示出高度多孔的蜂窝状结构，这是由于在紫外光照射下自由基聚合形成，这有利于水凝胶良好的吸水性和保水性。图8中(a)～图(d)图显示M-PHMG投入量越多，水凝胶内部孔隙直径越小，但是当质量比Dex-MA:M-PHMG＝5∶1时，由于M-PHMG中的胍基含量较大，而胍基比羟基的亲水性更加优良，导致水凝胶除了有更加致密的孔隙，部分区域还有较大的空隙。

图8 (a)gel-1、(b)gel-2、(c)gel-3、(d)gel-4、(e)gel-5的水凝胶内部SEM图

对织物进行SEM测试，结果如图9所示。其中(a)和(f)为原棉织物及其局部放大图，可见其纤维纵向呈扁平卷曲状，表面较为平滑；接枝长链烷基季铵盐后，CCT-1纤维表面变得粗糙，随着季铵盐投入量的增加，棉纤维表面变得更加粗糙并且出现颗粒状痕迹；CCT-4在CCT-3的基础上接枝KH-570，在纤维表面可以观察到更多鳞片形的块状物。硅烷偶联剂在与棉纤维发生反应时，硅氧烷上的三个甲氧基先水解生成硅烷醇，然后硅烷醇通过缩合反应与棉纤维表面的羟基反应形成-Si-OSi-共价键，同时，硅烷醇基团自身也会发生缩合，因此经过长链烷基季铵盐和KH-570接枝后的改性棉纤维表面粗糙且分布有块状物。

图9 改性棉织物SEM图(a)CT、(b)CCT-1、(c)CCT-2、(d)CCT-3、(e)CCT-4、(f)～(g)分别为对应的放大图

2.4 溶胀性能分析

水凝胶的溶胀性能，如图10所示，gel-1、gel-2、gel-3、gel-4、gel-5的溶胀倍数分别为23.045倍、6.082倍、6.854倍、6.984倍、5.512倍。据图10所知，水凝胶具有很强的溶胀能力，且水凝胶交联密度越大则内部孔隙越小，则溶胀性能越小[9]。

图10 不同配比水凝胶溶胀图

2.5 定性抗菌性能分析

由于季铵盐的抗菌方式为接触型抗菌，通过观察琼脂与织物相接触部分有无菌落生长来判断织物是否有抗菌效果。如下页图11所示，移除对照组原棉CT发现接触部分菌落正常生长，没有任何抗菌痕迹。而CCT-1、CCT-2、CCT-3和CCT-4样品，将改性织物移除后可以观察到与织物接触部分均无细菌生长，说明了改性后的棉织物都有一定的抗菌性能。

图11 改性棉织物定性抗菌图

2.6 定量抗菌性能分析

对改性织物以及织物复合水凝胶敷料进行定量抗菌实验，样品抗菌结果如下页图12所示。CT、CCT-1、CCT-2、CCT-3、CCT-4、CCT-4-gel对大肠杆菌的抑菌率分别为68.33%、91.67%、95.00%、96.67%、98.33%、99.83%；CT、CCT-1、CCT-2、CCT-3、CCT-4、CCT-4-gel水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑率分别为51.38%、88.89%、91.67%、94.44%、97.22%、99.86%。可以看出季铵盐的添加含量越大时，所制备的水凝胶材料才抗菌性能越好，而且通过CCT-4-gel可推断季铵盐和KH-570具有协同抗菌作用。

图12 改性棉织物定量抗菌图

2.7 水凝胶复合棉织物敷料的止血性能分析

小鼠断尾出血模型止血试验的止血时间如图13所示。从图13可以看出，第1组(CCT-4-gel-6)的平均止血时间约为166 s，第2组(CCT-4-gel-7)的平均止血时间约为143 s，第3组(CCT-4-gel-8)的平均止血时间约为7 s，第4组(CCT-4-gel-9)的平均止血时间约为5 s。止血时间越短，止血性能越好。

图13 水凝胶复合棉织物敷料的止血时间图

3 结论

本文制备了Dex-MA和M-PHMG单体，通过在棉织物上接枝十六烷基季铵盐和KH-570制备改性棉织物，将经过改性的葡聚糖单体溶于去离子水中，再添加M-PHMG、凝血酶以及光引发剂，将改性后的抗菌织物浸泡在上述混合溶液中，通过紫外光原位交联方式制备水凝胶基棉织物敷料。经各项性能测试，说明该水凝胶基棉织物敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率达到99.83%和99.86%，季铵盐和抗菌胍盐具有协同抗菌作用。同时，由于凝血酶的加入，该医用敷料具有良好的止血效果，水凝胶敷料CCT-4-gel-9可实现5秒左右止血功能。水凝胶的微孔结构还具有吸附伤口渗液功能，同时保持伤口的湿润环境，为伤口创造良好的恢复环境。