芹菜素对一氧化碳中毒致神经元凋亡的影响❋

白美玲，刘星亮，焦 宏△

(1.河北北方学院基础医学院，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000)

芹菜有水芹、旱芹两种，功能相近。中医认为药用以旱芹为佳，又称药芹。旱芹得青阳之气而生，气味辛窜，能理胃中湿浊。旱芹气味甘寒，能除心下烦热。或有得于阳气之微，故味苦而多湿；得于阳气之浓，故味多辛而燥[1]。芹菜中分离纯化的活性成分以芹菜素为高[2]。芹菜素(Apigenin)又名芹黄素，是一种可以从多种中草药和食物中提取的黄酮类化合物。有研究表明，芹菜素在抗肿瘤、抗氧化、抗炎症等方面疗效显著[3]。近年来，芹菜素在中枢神经系统疾病中对神经细胞的保护功效受到学者们的关注[4]。

一氧化碳(carbon monoxide, CO)中毒是较为常见的中毒事件，由于CO占据氧气与血红蛋白结合位点，间接引起人体缺氧而导致中枢神经系统等多器官受损，出现嗜睡、昏迷、神经官能症等神经系统的症状和体征[5，6]，而CO中毒引发的缺血缺氧又可导致神经元凋亡，B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族蛋白与细胞凋亡密切相关。

本实验通过建立体外CO中毒的神经元模型，以实验常用的神经元模型[7]，即大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞为靶点，通过外源性一氧化碳释放分子(carbon monoxide releasing molecules, CORM-2)对PC12细胞作用，检测芹菜素对CO中毒后神经元凋亡情况及相关凋亡蛋白Caspase-3、BCL2-Associated X的蛋白质(BCL2-Associated X, Bax)和Bcl-2含量，探讨芹菜素对CO引起的细胞凋亡的影响，为临床CO中毒患者的治疗和预后康复提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞(高分化型)由我校药学系老师惠赠，购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。CORM-2(美国Sigma公司288144-500 MG)；芹菜素(陕西慧科植物开发有限公司，CAS：520-36-5)；兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体(sc-56051)、Bax单克隆抗体(sc-7480)和Bcl-2单克隆抗体(sc-7382)，美国Santa Cruz公司；细胞早期凋亡检测试剂盒(559763)，美国BD公司。

1.2 细胞培养与模型建立

PC12细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基置于37 ℃、5%CO2孵育箱进行培养。待细胞覆盖率达90%左右时，常规胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行下一步实验。

收集PC12细胞后计数并调整细胞浓度，以2.5×104个/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔100 μL，每组设平行复孔6个。分别以50 μM、100 μM和200 μM的CORM-2诱导PC12细胞2 h和4 h，建立外源性CO中毒神经元模型。

1.3 MTT实验检测细胞存活率和细胞分组

选择490 nm波长，在全自动荧光酶标仪上检测各孔的吸光度(optical density, OD)值。通过下列公式计算各组细胞生长抑制率：生长抑制率(%)=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100﹪。MTT实验通过细胞活性和半数致死量来确定CORM-2最佳诱导浓度并确定分组。本次实验分为Control组(常规培养PC12细胞)、CORM-2组(最佳诱导浓度)、低剂量芹菜素干预组(CORM-2+5 μM芹菜素)和高剂量芹菜素干预组(CORM-2+20 μM高浓度芹菜素)4组。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

收集4 h作用的各组细胞1×106个，离心后弃去培养基，采用1 mL PBS缓冲液洗涤2遍，按照试剂盒说明依次向每组细胞中分别加入185 μL缓冲液，5 μL Annexin V及10 μL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)，混匀避光20 min。离心并弃去上清液，再加入1 mL PBS洗涤1次。1 mL PBS缓冲液悬起细胞，上流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况。

1.5 Western blot检测凋亡蛋白含量

各组加入蛋白裂解液提取总蛋白，用Bio-Rad蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，电泳、转膜、封闭分别加入兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体(稀释度为1∶1000)、Bax单克隆抗体(稀释度为1∶1000)和Bcl-2单克隆抗体(稀释度为1∶1000)，4 ℃过夜。清洗后加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育1 h，加 3,3-N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride(DAB)显色。显影后照相，图像分析软件Image J进行定量分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计分析，2组均数比较采用t检验，多组资料统计采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外PC12细胞CO中毒模型的建立与最佳作用浓度筛选

PC12细胞分别于2 h和4 h经50、100和200 μM浓度的CORM-2诱导后，利用MTT法测定细胞活性。图1示，相同诱导时间下细胞活力随CORM-2浓度的增高而逐渐下降，确定100 μM CORM-2诱导4 h为CO中毒细胞模型最佳作用浓度和最佳作用时间，作为后续实验CORM-2组。

图1 MTT法检测CORM-2诱导下PC12的细胞活性率

2.2 各组PC12细胞凋亡检测

采用流式细胞术Annexin V-FITC和PI双染检测细胞早期凋亡率。Control组细胞凋亡率为2.21%，CORM-2诱导组细胞凋亡率急剧上升至29.49%；加入5 μM芹菜素干预后，细胞凋亡率下降至8.28%，与CORM-2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，以上结果说明，芹菜素能有效抑制CORM-2诱导的细胞凋亡。

2.3 各组PC12细胞凋亡蛋白的表达

图3示，CORM-2组Caspase-3表达明显高于Control组(P<0.05)，低剂量芹菜素干预组和高剂量芹菜素干预组Caspase-3表达均明显低于CORM-2组(P<0.05)。Control组Bax表达水平显著低于CORM-2组(P<0.05)，低剂量芹菜素干预组的Bax表达明显低于CORM-2组(P<0.05)。CORM-2组Bcl-2表达明显高于Control组(P<0.05)，低剂量芹菜素干预组和高剂量芹菜素干预组Bcl-2表达水平均显著高于CORM-2组(P<0.05)。结果表明，芹菜素可以通过下调Caspase-3及Bax，上调Bcl的表达，减缓PC12的细胞凋亡过程。

注：L-Api为低浓度芹菜素干预组, H-Api为高浓度芹菜素干预组

注：C表示Control组，L-Api为低浓度芹菜素干预组，H-Api组为高浓度芹菜素干预

3 讨论

脑组织尤其神经元对缺血缺氧最不耐受[8]，其次是胶质细胞，血管内皮细胞耐受力最佳[9]。有研究发现，CO中毒死亡者尸检结果中，大脑皮质的神经元有不同程度凋亡[10]，表明CO中毒所致的嗜睡、昏迷等临床表现与神经元的凋亡可能有很大的相关性。而CO中毒所引发的神经系统损伤表现出的临床症状属于中医学“头痛”“健忘”“痴呆”等范畴。有学者根据中医辨病辨证方法，将CO中毒的机理病因病机和相应临床症状解释为CO秽浊毒气由肺而入，毒邪入内耗散正气，毒邪生热化痰，痰瘀互结，上蒙清窍，气滞血瘀，痰浊阻滞，窍络闭阻[11]。

临床对于CO中毒患者以高压氧治疗为主，但起效较慢[12]。学者们正在探究用安全高效的中草药或某些植物的活性成分进行辅助治疗，以减缓神经元凋亡，增强高压氧疗效，减轻患者中毒症状，提升患者的生活质量。

芹菜作为一种药食同源的原料，性凉、味甘辛且无毒，入肺、胃、肝经，可清热利湿、平肝健胃、除烦消肿、凉血止血、解毒宣肺、健脑镇静。《本草纲目》云：“旱芹，其性滑利。”《卫生通讯》载芹菜“清胃涤热，通利血脉，利口齿润喉，明目通鼻，醒脑健胃，润肺止咳”。《本草推陈》载芹菜“治肝阳头痛，面红目赤，头重脚轻，步行飘摇等症”[13]。芹菜中以活性成分芹菜素含量为高，芹菜素分子式为C15H10O6，相对分子量270属于4’,5,7-三羟基黄酮，是一种药食同源的活性化合物，广泛存在于芹菜、毛叶藜芦等植物以及日常多种豆类、茶叶等食物中[14]。有研究显示，芹菜素具有降血压、抗癌、降血脂、保护神经元等活性作用，其用药安全性高[15]。

近年来学者们通过临床观察发现，芹菜素对神经系统疾病包括脊髓损伤、神经退行性疾病、失眠及抑郁等神经官能症均有一定的治疗效果[16，17]。有报道，芹菜素可通过血脑屏障进入脑组织中，发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，通过减缓氧化应激反应，在一定程度上恢复或改善大鼠脊髓损伤后神经功能的缺失，减轻神经元凋亡，有效保护神经元活力[18]。在一项阿尔茨海默病的临床研究中[19]，通过对患者进行两年的观察和随访后发现，长期服用芹菜素复方制剂的患者认知评分明显高于未服用者，说明芹菜素在一定程度上能有效改善阿尔茨海默病患者的临床症状，促进患者康复。此外也有临床报道证实，芹菜素在改善失眠、调节人体生物节律等方面有重要功效[20]。

动物实验也证实，芹菜素对神经元损伤有治疗效果，其机制与芹菜素调控氧化应激和促凋亡方面有关。研究发现，服用芹菜素在抗抑郁及改善小鼠认知能力等方面有显著作用[21]。此外，芹菜素在帕金森病转基因果蝇模型中，也表现出抑制氧化应激、减缓细胞凋亡的作用[22]。通过阻断Ca2+的细胞信号传导途径，减少促凋亡蛋白caspase-3和caspase-7的释放，可抑制神经元凋亡，保护神经元的活性和稳定性[23]。本研究结果也发现，芹菜素能有效降低CORM-2诱导的PC12细胞凋亡率,提示芹菜素可通过对减缓抗神经元凋亡来降低CO对神经元造成的损伤。细胞凋亡是程序性细胞死亡的过程，是由一些病理因素刺激细胞引发凋亡通路的激活、表达和调控的一系列生化反应。大多数凋亡的启动、激活与调控都与Bcl-2家族和Caspase家族有关[24]。Caspase家族可以通过细胞内通路(线粒体途径)、细胞外通路(细胞膜途径)、内质网通路等激活细胞凋亡[25]。有研究显示，Caspase的激活是包括一系列生化反应，凋亡的启动因子与信号蛋白结合后激活引起线粒体功能障碍，导致细胞色素C从线粒体释放入细胞胞浆并与胞浆中的凋亡蛋白酶激活因子1聚合成为复合体，这种多聚复合物激活Caspase-9引起级联反应，进而激活Caspase-3引起染色体断裂，引起细胞凋亡[26]。Bcl-2家族中包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两部分。抗凋亡蛋白如Bcl-2通过调节线粒体膜电位阻断细胞色素C的释放，并阻止凋亡诱导因子进入细胞质。而Bax蛋白发挥促凋亡活性，可促进细胞色素C的释放，故认为Bcl-2通过抑制细胞色素C的释放，以阻止Caspase-3的激活[27]。

本研究还发现，与CORM-2组比较，芹菜素能够降低CORM-2诱导PC12细胞中Bax和Caspase-3蛋白的表达，同时上调Bcl-2蛋白的表达，其作用效果与芹菜素的浓度呈正相关。本实验结果说明，芹菜素可以通过有效抑制促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达，同时促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，以减轻CO中毒导致的神经元凋亡，具有潜在的保护神经元作用。