慢性阻塞性肺疾病发病易感性与单核苷酸多态性相关

夏岑峰，王 娜，张 鹏

(宁夏医科大学总医院 心脑血管病医院 呼吸与危重症医学科， 宁夏 银川 750004)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmori-ary disease, COPD，简称慢阻肺)是一种常见的由有害气体刺激所致的慢性肺部异常炎性疾病，一般以气流受限且不完全可逆为特征。慢阻肺的发生表现出明显的可遗传特征[1]。目前，研究慢阻肺的候选基因有很多，主要集中在炎性相关基因：壳三糖苷酶/几丁质酶1(chitotriosidase/chitinase 1，CHIT1)水平在慢阻肺患者体内明显失调[2]，CHIT1的多态性对慢阻肺患者肺功能下降有显著影响[3]；磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D，PDE4D)与多种炎性细胞的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水解有关。PDE4D基因rs16878037位点的多态性被证明与COPD显著相关，且存在种族间差异，在吸烟的慢阻肺病人中，PDE4D呈现出高表达[4]。由此说明，CHIT1和PDE4D均与慢阻肺疾病相关。

本研究选取中国汉族和中国蒙古族CHIT1基因的4个位点rs771576027、rs1402870472、rs61745299、rs527497633和PDE4D基因的1个位点rs117292391，研究基因多态性与慢阻肺发病的关系，为早期诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例：收集宁夏医科大学总医院2015年7月至2018年7月被诊断为慢阻肺的患者，随机选取汉族患者237例和蒙古族患者207例，共444例归为患病组。另外，随机选择同期体检的健康汉族人215例和蒙古族人219例，共434名作为对照组。对所有来诊人群均进行了吸烟情况和幼儿时期呼吸病史等信息的记录。本研究方案经宁夏医科大学总医院伦理审查委员会审查批准；所有参与研究的志愿者均签署知情同意书。

1.1.2 试剂： 虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)、ddNTPs(Sigma公司)；其他试剂(天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样本DNA的提取：采集外周血5 mL，EDTA抗凝后离心留取血细胞，依次加入细胞裂解液、核溶解液、蛋白沉淀液、异丙醇和75%乙醇处理后，加入ddH2O，65 ℃水浴2 h。利用nanodrop-2000仪器检测提取出的DNA的浓度及纯度。

1.2.2 基因型的检测：对目的SNP序列进行扩增，反应程序为：95 ℃ 15 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环45次；72 ℃ 5 min。再加入SAP用于消除多余的dNTPs和引物，反应程序为：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。之后加入单个ddNTP进行单碱基延伸反应，反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，循环45次；72 ℃ 3 min。将最终反应产物点样于芯片上，通过Sequenom MassARRAY SNP检测平台，利用质谱分析技术对PDE4D基因和CHIT1基因上的所有位点进行基因分型检测。其中每个位点的call rate参数值设置为>90%，最终得到基因位点的描述性统计。

1.3 统计学分析

应用SPSS.19软件对数据进行统计学分析，采用Logistic回归得出优势比(OR/Exp)和95%置信区间；校正吸烟情况和幼儿呼吸病史因素的影响后，对SNP位点与慢阻肺的易感性进行关联分析。用卡方检验方法对各基因型和等位基因频率分布进行分析。得到的数据计量以n(%)的形式表示。使用SPSS方差分析Bonferroni法两两比较校正P值作为显著性评判标准。

2 结果

2.1 两组的基本信息

将878份就诊病例(其中对照组434例，患病组444例)的基本信息进行卡方检验，吸烟与否及rs61745299(CHIT1)、rs117292391(PDE4D)的基因型分布频率与患病存在显著差异(P<0.05)(表1)。蒙族和汉族之间无显著差异(表2)。

表1 患病组与对照组的基本信息

表2 不同民族人群基因型Table 2 Genotypes of different nationalities

2.2 Logistic回归分析

吸烟能够增加慢阻肺疾病的发生风险(P<0.05)；吸烟人群发生慢阻肺的风险比不吸烟人群高约1.4倍(Exp=1.401, 95%CI=1.074～1.827)。

2.3 CHIT1基因与慢阻肺易感性的关系

CHIT1位点rs61745299的基因型和等位基因在患病组和对照组中的分布显示，基因型CC和CG、等位基因C均为慢阻肺发生的危险因素，其中基因型CG和等位基因C在两组间差异显著(P<0.05)(表3)。

表3 两组中CHIT1的rs61745299位点基因型和等位基因分布Table 3 Genotype and allele distribution of rs61745299 in CHIT1 of the two groups[n(%)]

2.4 PDE4D基因与慢阻肺易感性的关系

PDE4D位点rs117292391的基因型和等位基因在患病组和对照组中的分布显示，基因型AG和等位基因G为慢阻肺发生的危险因素，且都在两组间差异显著 (P<0.05)(表4)。

表4 两组中PDE4D的rs117292391位点基因型和等位基因分布Table 4 Genotype and allele distribution of rs117292391 in PDE4D of the two groups[n(%)]

3 讨论

CHIT1位于人类1号染色体q31-q32，共包含12个外显子，长度约20 kb。CHIT1主要在髓样细胞中表达，包括嗜中性粒细胞、成熟的单核细胞衍生的巨噬细胞、肺巨噬细胞、肺和肠中其他特定的组织巨噬细胞和上皮细胞。当细胞中的Toll 样受体(Toll-like receptor，TLR)受到刺激后就会释放出CHIT1[5]，CHIT1可以增强转化生长因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)受体的表达和信号传导，还可以修饰组织的纤维化和气道重塑[6]。由于COPD是由异常损伤和组织修复反应引起的慢性肺部疾病，因此CHIT1在疾病发生中的作用和致病机制非常重要。本研究证明了CHIT1的rs61745299位点的基因型CG和等位基因C增加患慢阻肺疾病的风险，CHIT1可能成为COPD的生物标志物。

一方面，PDE4D可以通过降解cAMP来调控炎性细胞[7]，进而调节免疫细胞功能，另一方面控制气道平滑肌的舒张[8]。COPD是一种进行性发展的疾病，与遗传因素相关。日本人群中PDE4D的rs829259位点与COPD发病相关，而中国人群中PDE4D上的rs35386位点与COPD发病相关[9]。本研究发现PDE4D上的rs117292391位点与COPD发病相关，且基因型AG和等位基因G会增加发病风险。

吸烟是导致COPD的重要因素之一。吸烟患者体内α1-抗胰蛋白酶(AAT)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的变化进而引起对COPD易感[10]。肺部的抗氧化系统失衡形成的氧化应激也会导致COPD的发生[11]。总之，COPD是遗传因素与环境因素相互作用的结果，其易感性与二者均有关系。

根据本研究结果，CHIT1的rs61745299位点和PDE4D的rs117292391位点在汉族和蒙古族患者之间不存在显著差异，但这两个位点的多态性单独在汉族群体或蒙古族群体中是否与慢阻肺显著相关，需要进一步分析和验证。