miR-146a调控NOTCH2表达对剥脱综合征性青光眼患者炎性因子水平的影响▲

万新娟 蒋 晨 谢小东 王慧琴 丁 琳

(新疆维吾尔自治区人民医院1 眼科，2 临床医学研究中心，新疆乌鲁木齐市 830001)

剥脱综合征(exfoliation syndrome，XFS) 是全球范围内的常见疾病，是一种多因素相关的迟发性疾病[1]。XFS主要表现为无定形灰白色蛋白质碎屑沉积于晶状体前囊及基底膜等眼组织[1-3]，患者常合并青光眼、白内障等病症。XFS的发病机制尚不明确，且目前尚无可以预防XFS发生的方法。前期研究发现Notch信号通路中的某些差异表达基因可能参与XFS的发病过程，且XFS性青光眼患者血浆中多个Notch信号通路相关基因异常表达[1]，但相关文献报告较少。因此，本研究通过比较XFS性青光眼患者和正常人群的miR-146a、Notch受体2(Notch receptor 2，NOTCH2)基因及其靶蛋白表达水平，分析下游炎性因子的变化，探讨XFS性青光眼发病的影响因素。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月至2020年12月于我院眼科就诊的15例XFS性青光眼患者作为XFS性青光眼组，其中男性8例、女性7例，年龄49～79(69.82±9.32)岁。纳入标准：符合XFS的诊断标准，即晶状体前囊膜及瞳孔缘有典型白色碎屑样沉积物，且眼压>20 mmHg，垂直杯盘比>0.7，伴有视野缺损[2]；近1个月内未接受过降眼压等治疗者。另选取同期在我院进行健康体检的正常健康人15例为对照组，其中男性8例、女性7例，年龄47～80(68.19±8.16)岁。对照组研究对象无眼部疾病，与观察组无血缘关系，体检结果未见异常。两组的排除标准：恶性肿瘤、自身免疫性疾病、高血压、糖尿病的患者，既往有强烈红外线接触史、眼科手术史的患者，妊娠、哺乳及月经期的患者。本研究已通过我院医学伦理委员会批准，且所有研究对象或家属均签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量PCR检测miR-146a、NOTCH2 mRNA的表达水平 于XFS性青光眼组患者在门诊就诊时、对照组研究对象体检时，采集其外周血5～10 mL，置于含乙二胺四乙酸二钾抗凝管中，反复颠倒使抗凝剂与血液充分混匀，置于-80 ℃冰箱保存。3 000 r/min离心15 min(离心半径为10 cm)，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取富含白细胞的细胞群。加入裂解液，提取样本总RNA。采用超微量核酸蛋白测定仪(Thermo公司)测定其浓度及纯度，OD260/OD280比值在1.8～2.2之间，可用于后续实验。将RNA反转录合成cDNA，反转录反应体系包括5×PrimeScript Buffer 2 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μL、15 μM Oligo(dT)0.5 μL、100 μM Random 6 mers 0.5 μL、总RNA 500 ng，加入RNase- free dH2O使总体积达到10 μL。混匀后于常温下3 000 r/min离心15 s。在PCR仪(德国Rotor-Gene Q，Rotor-Gene Q5)上37 ℃温浴15 min，85 ℃加热5 s，加入RNase-free water稀释至35 μL，得到反转录cDNA产物，进行实时荧光定量PCR反应。反应体系包括10 μM上下游引物各0.4 μL、2×SYBR Select Master Mix 10 μL、RNase-free water 4.8 μL、cDNA模板4 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL，总体积为20 μL。miR-146a和NOTCH2的PCR引物购自德国凯杰公司(专利产品受知识产权保护暂不提供序列)。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，40个循环；熔解曲线60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，1个循环。每个样本均设置3个复孔，运行结束后使用Rotor-Gene Q Series Software进行数据分析，以U6为miR-146a内参、以GAPDH为NOTCH2内参，引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算miR-146a、NOTCH2 mRNA表达水平。实验重复3次。

表1 内参的引物序列

1.3 Western blot检测NOTCH2蛋白表达水平 取1.2获得的富含白细胞的细胞群，采用RIPA裂解液裂解细胞，使用二辛可宁酸法测定NOTCH2蛋白浓度。配制12%的分离胶，取20 μL蛋白进行SDS-PAGE；待目的条带进入凝胶最佳分离区时，停止电泳。将蛋白转印至PVDF膜上，使用5%的脱脂奶粉封闭液室温封闭转印膜1 h后，用TBST洗膜3次，10 min/次。然后加入NOTCH2一抗(英国Abcam公司，稀释比为1 ∶5 000)，GAPDH一抗(北京中山金桥生物技术有限公司，稀释比为1 ∶1 000)，室温孵育1 h；TBST洗膜3次，10 min/次，然后加入鼠抗兔二抗(北京中山金桥生物技术有限公司，稀释比为1 ∶1 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。以GAPDH为内参蛋白，经暗室曝光成像后，采用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。实验重复3次。

1.4 ELISA检测白细胞介素6表达水平 于XFS性青光眼组患者门诊就诊时、对照组研究对象体检时，采集其外周血3 mL，室温静置15 min后常温3 000 r/min离心5 min，取上清，使用人白细胞介素(interleukin，IL)-6 ELISA试剂盒(英国Abcam公司，批号：ab246838)检测血清IL-6水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，实验重复3次。

1.5 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组miR-146a、NOTCH2 mRNA表达水平的比较 XFS性青光眼组的miR-146a表达水平低于对照组，而NOTCH2 mRNA表达水平高于对照组(均P<0.05)。见表2。

表2 两组miR-146a、NOTCH2 mRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.2 两组NOTCH2蛋白表达水平的比较 XFS性青光眼组的NOTCH2蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)。见表3和图1。

表3 两组NOTCH2蛋白相对表达水平的比较(x±s)

2.3 两组血清IL-6表达水平的比较 对照组血清IL-6表达水平为(76.162±16.785)pg/mL，XFS性青光眼组血清IL-6表达水平为(186.289±36.278)pg/mL，XFS性青光眼组血清IL-6表达水平高于对照组(t=10.670，P<0.001)。

3 讨 论

XFS是一种细胞外基质代谢异常疾病[1-6]，受到遗传、环境、年龄等多种因素的影响。XFS累及眼部后，由于不明纤维物质在眼部组织中沉积，导致房水外流受阻，引起眼压增高和视神经受损，严重者可致盲[1-6]。XFS所致眼部病变的发病原因尚不明确，目前的研究表明，XFS所致眼部病变是由细胞外基质异常分泌、剥脱蛋白等物质未能充分降解所致[7-9]。研究发现，炎性相关Notch信号通路中的Jagged1、Jagged2 等基因在XFS所致眼部病变患者中存在差异表达，Notch信号通路的主要受体蛋白NOTCH2可与其配体结合，通过对暴露的金属酶切位点进行酶切，释放Notch细胞内结构域[1,10-11]；Notch细胞内结构域进入细胞核后与转录抑制因子结合，进一步激活发状分裂相关增强子，从而对细胞进行调控，参与细胞增殖、凋亡等生理过程[10-13]。

miR-146a位于第5号染色体上，具有调节免疫系统的作用[14-17]，其参与的复杂的基因调控网络在生物体的造血、炎症、免疫等生理、病理过程，以及肿瘤的发生、发展过程中均发挥着重要的作用[14-17]。既往研究发现，miR-146a异常表达与眼球衰老、干眼、糖尿病视网膜病变和黄斑变性等疾病的发展过程密切相关[18-21]。因此我们推测miR-146a可能参与XFS性青光眼的发生和发展过程。而Wang等[13]提出，miR-146a可能通过直接靶向NOTCH2增加IL-6水平，加快Graves眼病的进展；并且我们课题组前期分别使用starBase v3.0、miRWalk生物信息学数据库预测miR-146a的潜在靶基因，发现NOTCH2是miR-146a的靶基因。故本研究分析miR-146a调控NOTCH2的表达对XFS性青光眼炎性因子的影响。结果显示，XFS性青光眼患者的miR-146a表达水平低于正常健康人群(P<0.05)，说明miR-146a可能参与了XFS性青光眼的发生和发展过程；而XFS性青光眼患者的NOTCH2 mRNA表达水平和蛋白表达水平均高于正常健康人群(P<0.05)，提示NOTCH2基因及蛋白表达的异常升高，其可能与XFS性青光眼的发生有关。本研究还发现，与正常健康人群比较，XFS性青光眼患者血清IL-6表达水平升高(P<0.05)，说明炎性因子IL-6的异常表达对XFS性青光眼的发生和发展具有重要意义。

正常情况下，眼部剥脱物质和细胞碎片可被小梁细胞吞噬[1]，但在XFS性青光眼患者机体中这一平衡状态被打破，白色碎屑样沉积物堆积在晶状体前囊膜及瞳孔缘等部位，这可能是与miR-146a调控NOTCH2的表达，进而调控细胞异常代谢过程，释放大量炎性因子有关。结合本研究结果，我们推测miR-146a可能通过调节NOTCH2及IL-6的表达，参与XFS性青光眼的发生和发展。

综上所述，XFS性青光眼患者 miR-146a、NOTCH2、IL-6表达异常。miR-146a可能通过靶向调控NOTCH2基因及蛋白表达水平作用于炎性因子IL-6，引发炎性反应，从而参与XFS性青光眼的发生和发展过程，但其作用机制有待深入研究。探寻XFS性青光眼发生和发展可能的影响因素，可为深入研究XFS所致眼部疾病奠定基础。