植物染色体倍性鉴定方法及其在桑树研究中的应用

陆晓媚 林强 唐燕梅 曾燕蓉 刘丹 李韬 朱光书 张朝华 邱长玉

(广西壮族自治区蚕业技术推广站， 南宁 530007)

植物染色体是遗传物质的载体，开展染色体倍性鉴定是植物种质资源评价的重要内容之一，明确植物染色体的倍性有助于创新植物种质材料及开展多倍体育种，同时鉴别植物倍性水平还对研究其系统进化、物种起源模式等具有重要的意义。本文在综述国内外关于植物染色体倍性鉴定方法的基础上，概述其在桑树种质资源及多倍体育种上的应用，同时针对各种鉴定方法存在的优点和缺点展开相应的分析与讨论，以期为发掘更多的优异桑树种质资源服务于桑树产业提供理论参考。

1 植物染色体倍性鉴定方法

植物倍性水平鉴定分直接和间接鉴定两大类方法[1]。直接鉴定方法又称染色体计数法；间接鉴定方法中常用的有植物形态指标鉴定法、细胞形态学鉴定法、流式细胞术鉴定法、分子标记鉴定法、同工酶鉴定法和生理生化指标鉴定法等[1-2]。

1.1 直接鉴定法

染色体计数法是一种最直接且准确的鉴定方法，制片材料大多选择细胞旺盛分裂期的组织，取材部位可以是根尖、茎尖和幼叶，染色体制片方法有常规压片法、酸解去壁法、去壁低渗压片法、改良去壁低渗法。1987年以前，染色体计数多采用比较古老的压片法，随后陈瑞阳等[3]首创并推广了去壁低渗压片法，并成功应用于水稻、玉米、大豆、甘蔗、甘薯、黄瓜、棉花、菠萝、柿子、黄杨、桑树、吊兰等37科105种植物的染色体倍性鉴定，之后该方法又进一步改良并广泛应用于植物染色体倍性鉴定。

1.2 间接鉴定法

1.2.1 植物形态指标鉴定法

杨清淮[4]分析认为，植物根、茎、叶、花等的生物量随植物特定细胞染色体倍性的增加呈现正相关系数。植物形态指标鉴定是根据多倍体在整个生长周期内的外部形态特征如株高、茎粗、叶间距、叶片大小、叶片厚度、发条能力、生长势、种子形态、花粉大小、花器官大小、果实大小等外部形态特征，初步判断植物是否为多倍性。植物形态指标鉴定可在苗期进行观察，所以是能在早期初步判断植物多倍体的一种简便、快速又直观的鉴定方法。该方法已经应用于植物如灯盏花[5]、大白菜[6]、南瓜[7]、黑麦[8]、蝴蝶兰[9]等的倍性初步筛选。

1.2.2 细胞形态学鉴定法

多倍体植株通常表现为细胞体积增大、气孔大、保卫细胞大、叶绿体量多等。细胞学鉴定数据是染色体倍数鉴定的间接指标，通过观察植物气孔大小、密度、面积以及保卫细胞大小、密度和保卫细胞中的叶绿体数目、花粉粒形态、叶片解剖特征等方法来辅助判断植株的倍性。目前，气孔大小、气孔保卫细胞叶绿体数目等细胞学形态性状被作为多倍体鉴定的指标，已经在紫花宿目[10]、苹果[11]、梨[11]、葡萄[12]、西瓜[13]、何首乌[14]、月季[15]、橡胶[16]、黑麦[8]等多种植物上得到了研究和应用。

1.2.3 流式细胞术鉴定法

流式细胞术是通过检测植物大量细胞分裂期间G1期的DNA含量从而获取细胞倍性水平的方法，具有操作简单、检测速度快、准确性高、所需样品量少的优点。流式细胞术可以检测的植物样品来源较广，但新鲜的材料仍是最好的选择，如新鲜的嫩叶、愈伤组织和具有生长活力的原生质体；也可以选取冷冻和干燥后的材料，如冷冻后的嫩叶、干种子标本和经二氧化硅干燥处理后的材料等[17]。该项技术已广泛应用于植物多倍体、非整倍体、正常或异常细胞研究领域的实验与分析。目前，流式细胞术在多种植物染色体加倍或染色体倍性异常的检测方面均有报道，例如黑麦[18]、香蕉[19]、黄花苜蓿[20]、野生蔷薇[21]、枣[22]、桑树[23]、紫薇属[24]、油茶[25]、甜菜[26]、火龙果[27]、马铃薯[28]等。

1.2.4 分子标记鉴定法

分子标记鉴定法是利用简单重复序列(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、单核苷酸多态性(SNP)、荧光原位杂交(FISH)和基因组原位杂交(GISH)等分子检测手段开展植物倍性鉴定[24]。分子标记鉴定是一种初步判断植物倍性的手段，该方法已经广泛应用于植物的倍性鉴定。李伟强等[29]利用9对SSR引物检测448份美洲黑杨种质材料的倍性，通过统计扩增位点的等位基因数目，初步筛选出多倍体材料，再对筛选的多倍体材料采用流式细胞仪进行倍性鉴定，最后得出SSR分子标记可应用于美洲黑杨种质资源多倍体的初步筛选，再结合流式细胞仪可进行大批量快速检测美洲黑杨种质材料倍性的结论。

1.2.5 同工酶鉴定法

同工酶如过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、酯酶(EST)是普遍存在于植物中的酶类。通过对农作物如小麦[30]、玉米[30]、番茄[30]、萝卜[31,32]、苹果[33]、不结球白菜[34]等的研究认为，同工酶蛋白的表达与其基因组倍性呈正相关；而甘蓝的POD同工酶活性随其倍性的增加而减弱[30]。目前，通过不同倍性同工酶谱带的比较，对多倍体与二倍体植株的判定具有指导意义。

1.2.6 生理生化指标鉴定法

植物倍性鉴定方法除了能从染色体水平和植株外观形态、细胞学水平、分子水平、同工酶检测分析入手之外，还可以从生理生化指标入手，即对生理生化指标的测定也可以作为初步判断植物倍性的技术手段。不同倍性植物的含水量、渗透压力、呼吸和蒸腾作用特点、组织代谢物质及营养物质含量等是不相同的，因此，检测植株的生理生化指标，如可溶性糖、可溶性蛋白质的含量，抗氧化酶活性如SOD、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性以及叶绿素含量等指标，可以作为辅助判断植株倍性的依据之一[34-36]。

2 植物倍性鉴定方法在桑树研究方面的应用

桑树是家蚕的天然饲料树种，我国作为桑树种质资源最为丰富的国家，具有上千年的桑树栽培与育种历史。已有的研究表明桑树的倍性呈现多样化，已经发现的桑树种质资源包括天然单倍体、二倍体以及三倍体、四倍体、六倍体、八倍体、二十二倍体等。目前，植物染色体倍性鉴定方法在桑树研究中的应用，一方面是用于鉴定与评价现有的桑树种质资源，另一方面是用于诱导加倍的桑树育种材料鉴定，即应用在桑树多倍体诱导及种质材料的创新上。

2.1 在桑树种质资源鉴定与评价中的应用

染色体倍性鉴定方法主要是应用于对现有桑树种质资源的鉴定与评价方面。韩明斋等[37]收集来自陕西和国内外引进的桑树品种资源共130份，采用直接鉴定法中的酸解压片法观察其倍性，鉴别出86份二倍体、20份三倍体、4份四倍体、19份六倍体和1份单体。李存礼等[38]采用形态学鉴定法，从外部形态比较了三倍体桑品种嘉陵16号和其二倍体亲本品种，认为三倍体桑品种与二倍体桑品种相比具有如下特点：体细胞大、植株长势好、叶片大、叶质优、高产、高抗、生产效益高等。余茂德等[39]比较现有不同倍性即二倍体、三倍体、四倍体和六倍体桑树品种的气孔性状(气孔长、宽，气孔口近似面积，气孔数目)，结果表明上述多倍体的桑叶气孔口近似面积比二倍体高出10%左右，气孔大小与染色体倍数呈正相关，而单位叶片面积气孔数目与染色体倍数呈负相关。黎月娟等[40]采用流式细胞术检测来自广西壮族自治区的90份桑树品种资源的倍性，鉴别出32份二倍体、18份三倍体、30份四倍体、10份混倍体。丰富的多倍体种质资源为桑树多倍体育种奠定了基础。

2.2 在桑树种质材料创新上的应用

染色体倍数性鉴定方法在桑树种质材料创新上的应用，主要是用于鉴定诱导加倍的桑树种质材料。韩沙等[41]采用染色体压片法和流式细胞术两种方法检测诱变的桑树种质材料，发现结果略有差异，即压片法鉴定为单纯四倍体的植株，采用流式细胞仪检测其为混倍体，而且倍数性细胞比率在株系和部位间存在差异，证实了流式细胞仪可以快速且准确地检测出植株是否存在混倍体现象。王茜龄等[42]将人工杂交的二倍体无性系亲本通过染色体加倍处理后，获得果叶兼用的四倍体桑树新品种嘉陵30号，该品种与其二倍体亲本相比，具有叶片增大、增厚，叶肉肥厚，叶缘锯齿加厚，枝条长，果肉肥厚，产果量和产叶量高的优点。高丽霞等[43]对桂桑优62、粤桑11号和沙2×伦109的桑种进行染色体加倍诱导处理，并检测其诱导前后植株的体细胞、气孔大小和气孔数量，结果表明多倍体的体细胞、保卫细胞均比二倍体大，所含叶绿素增加了23%～50%，桑叶气孔的大小随倍数性的增加而变大，单位面积的气孔数量随倍数性的增加而减少。李晓双等[44]采用流式细胞术对加倍诱导处理后的野生长穗桑云7进行染色体倍性鉴定，获得2株稳定的十四倍体诱变植株。张有做等[45]利用RAPD技术比较不同倍性桑树品种基因组DNA的多态性，结果表明，二倍体与经加倍诱导的多倍体相比，其基因组DNA呈现多态性，这一研究对桑树诱变育种具有一定的应用价值。杨新华等[46]研究二倍体亲本新一之洓页与其诱变所得四倍体突变体的POD同工酶的酶谱，认为同工酶可以用于判断区分突变体和亲本新一之洓页[46]。

3 各种倍性鉴定方法的优点和缺点

3.1 直接鉴定法的优点和缺点

染色体计数法简单而准确，不过在其实际应用时优劣皆有之。例如，用酸解一步法检测桑树染色体倍性虽然操作步骤简单、流程少，但采用该方法不仅十分依赖于操作者的技术水平，对材料的敲击力度要求均匀，而且需要在众多细胞中找到染色体均匀、分散性良好的细胞，也不免费时费力，另外如细胞存在重叠情况会导致结果的不确定以及样品载玻片不能长时间保存等。随后王茜龄[47]开发的改良去壁低渗火焰干燥法虽然应用广泛，而且可以长时间保存染色体载玻片，但是其预处理、固定、低渗、酶解、染色等操作步骤仍较复杂且所花费时间较长，同样对实际操作者的技术水平要求高，检测效率较低，不适合进行大样本检测。

采用染色体计数法进行倍性鉴定，制备的样品是桑树有丝分裂中期的染色体，不管是压片法、酸解法，还是改良低渗去壁火焰干燥法，想要提高其制片质量则要求有较多的染色体分裂中期细胞，因此选取桑树材料的生长状况和取材时间是关键的因素[48]。通常选取生长季节的桑树顶芽或顶端即将展开的嫩芽作为材料，且同一天不同时间段取材制片获得的染色体有丝分裂中期分裂相多少也有区别。林强等[49]开发了一种直接酸解去壁法，并比较了当地2—11月份以及一天中各取样时间获得材料的制片镜检效果，结果表明，3—5月份每天的8:00—9:30、16:00—17:00，以及8-9月份每天的6:00—9:00、14:00—19:00取样获得桑树材料的染色体有丝分裂中期分裂相最多。

3.2 植株与细胞形态学指标及分子标记等鉴定方法的优点和缺点

植株形态指标鉴定法是一种较为直接、直观且粗放的筛选桑树多倍体的方法，但受操作者个人主观因素影响较大，且只能大概区分其是否为多倍体，不能精确得出其具体的倍数性，准确性不高，因此该方法目前只能作为一个初步判断方法。细胞学形态是一个间接性鉴定染色体的指标，不同品种其细胞学形态指标略有差异，很难作为独立的方法检测未知桑树材料的染色体数目，而且操作步骤相对复杂。分子标记鉴定法如SSR标记也只能通过杂合的等位基因位点来初步判断出植株的倍性，而等位基因位点为纯合时，则无法判断[50]。同工酶鉴定法、生理生化指标鉴定法也仅仅是可以作为辅助判断桑树倍性的方法使用。

3.3 流式细胞术鉴定法的优点和缺点

与染色体计数的方法相比较，利用流式细胞术进行植物的倍性鉴定虽然具有测定核DNA含量样品处理简单，测量精确、快速，所需材料少，适合大批量筛查等优点[51]，但在实际应用中还有许多问题需要解决。如需要找到合适的标准样品，以标准样品的染色体倍性作对照才能确定检测样品的染色体倍性，且样品制备、染色等均会对测定结果产生影响，因此同样对操作者的技术水平要求较高，并且仪器操作也相对复杂。另外，该技术不易鉴别非整倍体。总之，流式细胞术鉴定法虽然快速准确，但仍然存在着有一定的局限性。

桑树中普遍存在混倍体的现象。混倍体是指同一生物个体或组织中有不同倍性或不同数目染色体细胞，它既可存在于植株的局部，如某个芽、某片叶，一段茎或一段根中，也可能存在于整株植株[52]。混倍体的产生通常与外界条件的变化(如骤然低温、射线影响等)有关，因此它既可以是天然形成的，也可以经人工诱导产生。混倍体在桑树育种材料的挖掘与新品种选育上的应用是极为普遍的。目前，已有直接利用混倍体育成优良桑树新品种的报道，如鲁诱1号[53]，也有通过对混倍体进行无性分离，利用个体优势育成优良桑树新品种的，如陕桑305[54]。采用染色体计数法鉴定桑树材料是否为混倍体，具有一定难度，而流式细胞术是针对混倍体行之有效的鉴定方法，能准确且快速鉴定出材料是否为混倍体。因此，流式细胞术在桑树倍性鉴定上具有其他鉴定技术无法比拟、不可替代的优势，相信随着该技术的实验操作进一步完善，制备流程和染色剂的改进等，流式细胞术用于桑树倍性的检测结果会更加精确。

3.4 倍性鉴定方法的选取原则

综上分析认为，选择植物倍性鉴定方法的原则是：尽早筛选、低破坏性、高准确性和简单快捷[55]。鉴于桑树属于染色体较小且数目较多的植物，制片难度较大，为确保检测结果可靠和准确，针对目前的各种鉴定方法的优点和缺点，在实际操作中可采用先简单后繁琐的鉴定方法，必要时采用多种技术相结合的方法进行鉴定。总之，快速而准确地鉴定出桑树染色体的倍性，能为桑树种质资源的遗传学评价及合理保护和高效开发利用打下良好基础，更是可为桑树多倍体育种提供优异的种质材料，从而有效地节约育种成本及加快育种进程。