影响猪精子冷冻保存效果的研究进展

张 涵，王赫川，李天峰，张 群，王 骞，郭铭晖，李雁冰，魏国生，李井春

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

随着我国居民生活水平的提高，猪肉已经成为我国乃至世界上需求量最广泛的肉类。为了满足人类的需求，就必须专注于用更少的种猪生产更多品质优异的猪肉。目前精液保存方法主要有常温、低温和冷冻保存，常温保存精液技术操作简单，但精液保存时间超过48 h就会品质下降，而冷冻保存精液与常温保存精液相比，具有保存时间长、便于远距离运输和成本低等优点。猪精液在冷冻-解冻过程中易遭受损伤，造成精子受精能力下降。因此，人们开始不断探索在精液稀释液中加入一定量的抗氧化剂、保护剂、抗菌剂等物质来改善解冻后猪精子质量。加快猪精液冷冻保存技术的改良研究，有助于推动畜牧业发展，提高人民生活品质。

1 猪精液冷冻原理及损伤机制

猪精液冷冻主要是指新鲜采集的精液经过稀释等预处理后，利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）作为冷源，通过熏蒸或其他处理方式缓慢降温，然后在超低温状态下保存，使精子代谢速率降低或处于静止状态，便于长期保存，待解冻后精子仍具有活性和受精能力。

精子在冷冻保存过程中极易受到不同程度的物理损伤、氧化损伤和化学损伤。物理损伤通常指在精液冷冻时因温度下降过快，细胞内液体形成冰晶体从而对精子细胞内部及细胞膜造成不可逆损伤。通过控制温度下降速度可减少冰晶数量维持微晶状态，减少冷冻造成的物理损伤。氧化损伤是精子在冷冻过程中温度下降过快，精子氧化应激产生过多活性氧，造成膜上不饱和脂肪酸被氧化，产生大量脂质过氧化物，打破原本的氧化还原平衡状态和精子的完整结构，对精子造成不可恢复的损伤，也是细胞凋亡的重要因素之一。化学损伤是指精液在冷冻过程中，细胞外液最先形成冰晶，导致细胞内外渗透压不平衡，使细胞外液渗透压大于细胞内渗透压，水分从细胞内部流向细胞外液，造成精子脱水死亡。

2 影响猪精液冷冻保存质量的因素

2.1 冷冻温度和速率

降温处理是精液冷冻保存过程中重要的一步程序，降温主要指由新鲜采集的精液温度降低到冷冻保存的温度。降温需跨越一个危险温度区域，即-5℃至-60℃，温度的变化会影响精子的代谢功能，也会损害精子的顶体膜，降低膜的通透性，这种影响称为低温打击。低温打击对不同动物的精子影响程度不同，猪精子最敏感，牛、羊、马次之，兔、人和禽类较差。许多研究表明，控制降温速度可以减少或阻止低温打击的发生。精子细胞内冰晶未形成前，细胞外已结冰被认为是猪精子理想的冷冻效果。冷冻速率的快慢影响了冰晶的数目和大小，过快、过慢都会对精子造成严重的损害。

2.2 添加抗氧化剂

由于精子在冷冻过程中，精子膜上的不饱和脂肪酸会产生活性氧，活性氧的过量产生会导致氧化应激，造成精子线粒体损伤、质膜不完整、解冻后活力下降。许多研究为提高精液冷冻质量在精液的稀释液中加入一定的抗氧化剂来降低活性氧的含量，提高精子的存活率，增强猪冷冻精子的效用。

2.2.1 白藜芦醇

白藜芦醇是1940年从藜芦中分离出的多酚类二苯乙烯类化合物，葡萄、花生、虎杖是其主要的天然来源。由于其具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、防治心血管疾病等特性，使得它在食品添加剂、保健、化妆品、医药方面等领域广泛应用。在鸡、猪、人类和水牛的基础稀释液中添加白藜芦醇，其冻精的活力与鲜精差异不显著。菅芯蕊等应用25、50、100、200 μmol/L浓度的白藜芦醇对松辽黑猪精液进行冷冻保存，30 d后检测结果表明，在精液冷冻前添加50 μmol/L白藜芦醇效果最好，可改善解冻后的精子质量。

2.2.2 虾青素

虾青素属于酮式类胡萝卜素，是自然界中的一种强抗氧化剂，在真菌和海洋微生物中广泛分布，通常以游离形式存在。由于其结构式中含有异戊二烯共轭双键、羟基和不饱和酮基，容易和未配对的电子反应，所以能够有效地清除活性氧，保护脂肪酸免受脂质过氧化。Basioura等探讨了在猪精液冷冻保存过程中，添加虾青素对改善低温保存精子的质量和功能状态具有的潜在影响，且在解冻稀释液中添加0.5 μmol/L虾青素对公猪冷冻精子凋亡变化有微弱的促进作用。胡亚美在对猪精液常温保存时得出，添加0.25 μg/mL虾青素能提高精液ATP水平（腺嘌呤核苷三磷酸简称三磷酸腺苷，是一种不稳定的高能化合物）和乳酸脱氢酶活性，高线粒体膜电位比例增加，对精子的活力和运动参数都有所提高，但差异不显著。

2.2.3 芦丁及其他

芦丁又称维生素P，属于黄酮类化合物，是一种呈淡绿色或淡黄色的粉末，在芸香叶、枣、杏、番茄中广泛存在。其具有抗脂质氧化、抗自由基、抗病毒等作用。目前芦丁在猪冷冻精液保存中的研究还是比较少见的。吴林在长白猪的稀释精液中添加0.6 mmol/L的芦丁，使解冻后的精子运动能力增强，提高了精子的生理特征，显著降低了精子发生脂质过氧化反应。此外，在猪的基础稀释液中加入合适浓度的γ-谷维素、芝麻酚、绿原酸等抗氧化剂都能有效提高猪冷冻精子的质量。

2.3 添加抗菌物质

精液从采集、处理和保存中经常会被微生物污染，微生物会使精子质量下降并缩短精子寿命，受污染严重的精液可能会导致母畜发生子宫内膜炎等疾病，在精液稀释液中适当添加抗菌素可有效防止精子退化和疾病传播。Feng等结果表明在17℃液体储存公猪精液时，在稀释液中加入0.02 g/L磺胺与对照组相比，葡萄球菌和假单胞菌减少，并且将保存的精液用于人工授精后，母猪产仔数高于其对照组。

由于使用抗菌素会使部分细菌产生耐药性，对人类的健康造成了严重影响，所以学者们把研究重心放在了抗生素的替代品上。Alberto等研究茶树（互叶白千层）和迷迭香精油的非杀精浓度在冷藏猪精剂量液相上的抗菌能力时表明：互叶白千层和迷迭香精油，在0.4 mg/ml浓度下，对20%的精浆和80%的猪受精液混合物都能产生与氨苄青霉素相似的效果。抗菌肽PMAP-37被认为是能代替抗生素的候选物质之一，它能有效保持精子活力并控制细菌数量。另外，在猪精液低温保存技术中，温度也能够影响储存过程中细菌的传播，Waberski等证明，低温储存5℃，可减少抗菌素的使用。

2.4 冷冻保护剂

冷冻保护剂是猪精液稀释液中必不可少的组成部分，为了降低精子在冷冻保存过程中所遭受的冷打击伤害程度，许多学者选择在稀释液中添加一定量的冷冻保护剂来确保精液冷冻保存效果。目前，有渗透性和非渗透性两种冷冻保护剂，它们在冷冻保存过程中均可形成保护玻璃态，可以保存猪精子生物分子和细胞结构。

2.4.1 渗透性保护剂

渗透性保护剂大多是一些小分子物质，主要包括二甲基亚砜、甘油、二甲基甲酰胺、乙二醇等，它们在细胞冷冻悬液凝固之前，透过细胞膜渗透到细胞内部，使细胞内外溶液产生浓度差，而精子细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度降低，避免精子细胞脱水皱缩引起的损伤。但渗透性冷冻保护剂对精子而言，尤其是在高浓度情况下具有一定的毒害作用。目前猪精液冷冻保护剂中使用最常见的是甘油，其结构中的3个羟基可结合精液中的水分，使水分子形成冰晶得到控制，其烃链属于疏水基团，通过阻碍精子内水分渗透来保护精子免受损伤。Yang等研究不同浓度的甘油（0%，1%，2%，3%和5%）和二甲基乙酰胺（DMA：0%，1%，3%和5%）对猪精液冷冻后精子质量的影响得出，精液中含有5%的甘油的干冰冷冻精液组，解冻后精子活力、活率和顶体完整率优于其他组合，但含有3%甘油的干冰冷冻精液组，解冻后的精液质量指标效果最好；甘油和DMA联合使用和其他组相比，对提高冷冻存活率影响不大。但一些研究结果显示，稀释液加入甘油的浓度较高时，对精子产生毒害作用，降低受孕率，破坏精子的核膜。Pinho等在评估不同保护剂对Piau猪精液冷冻的可行性时，得出单独使用酰胺（3%）和甘油（2%）或与二甲基乙酰胺（5%）的组合比单独使用甘油对冷冻保护更有效。

2.4.2 非渗透性保护剂

非渗透性保护剂大多是一些大分子物质，主要包括卵黄、脱脂乳、羟乙基淀粉、海藻糖、白蛋白等，它们对精子不会产生毒性，主要通过调节精子细胞外液渗透压来控制细胞内冰晶的形成，从而保护精子免受损伤。近年来，非渗透性保护剂使用最广泛的是卵黄。卵黄中的胆固醇能够保持精子活力，卵黄中的脂质蛋白、卵磷脂类物质可防止精子遭受冷打击。汪俊跃等研究猪精子冷冻保存凋亡时，以高压均质蛋黄+Tris-柠檬酸-葡萄糖（TCG）稀释剂为处理组和普通蛋黄+三柠檬酸-葡萄糖（TCG）稀释剂为对照组，比较得出以高压均质蛋黄处理的精液，解冻后精子活力、活率、DNA完整率、线粒体膜电位和顶体完整率均优于对照组，推测高压后的蛋黄中蛋白质和脂质能更好地融合，降低了卵黄自身带有的微生物对冷冻后精液的影响，而Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性明显低于对照组，降低了在猪精液冷冻细胞的凋亡水平。钟观新对广东小耳花猪精液冷冻保存时发现，在稀释液中加入新鲜鸡蛋卵黄比陈旧鸡蛋卵黄效果好。

2.5 解冻温度和时间

猪精液在解冻过程中也需要跨过-25～-5℃的解冻危险区，并且解冻速率过慢会导致猪精子内部发生重结晶，与解冻液接触时间过长也会使精子遭受破坏；解冻速率过快会损害质膜完整性或出现没完全解冻的现象。因此，合适的解冻温度和速度对猪精子解冻至关重要。冷冻保存的猪精液目前有低温冰水解冻（0～5℃）、温水解冻（30～40℃）、高温解冻（50～70℃）等解冻方式。目前主要采用从液氮罐中取出猪冷冻精液的细管后，快速放入50℃的水浴锅中解冻10 s的方法解冻。Tomás等评估表明冻精在70℃解冻8 s时公猪精子活力和曲线速度、直线速度、平均路径和头部平均侧向位移幅度均高于冻精在37℃解冻20 s时观察的结果。凌培凤研究结果表明37℃解冻30 s和65 ℃解冻5 s是猪冷冻精液的最佳解冻温度。

3 小结

猪精液冷冻技术的发展充分利用了优秀的种猪资源，克服了地域间差异引起的不便，为养猪业的发展提供了巨大帮助。目前，冷冻保存技术在抗氧化剂、抗菌物质、冷冻保护剂等方面研究取得一定进展，但猪冷冻精液因解冻后效果不佳，经济成本较高等问题，在实际生产中的实践应用还需进一步研究与探讨。