局部缺血预处理脑保护分子机制的研究进展

冉秋林 刘志刚

(1. 中国医学科学院[北京协和医学院]， 北京 100000； 2. 泰达国际心血管病医院 心血管外科， 天津 300000)

1990年，Kitagawa等[1]每隔1天夹闭沙土鼠双侧颈总动脉2 min进行局部缺血预处理(local ischemic preconditioning, LIPC)，2次后闭塞双侧颈总动脉5 min诱导全脑缺血性损伤，研究发现LIPC可完全防止全脑5 min缺血引起的海马神经元死亡。该研究首次描述了脑缺血耐受(ischemia tolerance, IT)现象，此后针对脑缺血性损伤的各种缺血预处理策略被广泛研究，主要包括LIPC、远程缺血预处理和使用物理刺激或药物治疗的交叉预处理[2-3]。本文就近年来LIPC脑保护分子机制的研究进展进行综述，以期进一步探索和优化缺血预处理策略，改善缺血性脑血管病患者预后。

1 LIPC与血脑屏障

内皮细胞间的紧密连接和粘附连接对维持血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的完整性至关重要，组成跨膜紧密连接和粘附连接的紧密连接蛋白Claudin-5和钙粘蛋白Cadherin-5在LIPC后表达上调，并参与BBB细胞旁通透性的调节[4-5]。Yang等[6]使用7-0外科缝合线阻断小鼠左侧大脑中动脉12 min以进行LIPC，然后夹闭小鼠大脑中动脉60 min诱导缺血性卒中(ischemic stroke, IS)，研究发现，LIPC后脑微血管内皮细胞中转录因子核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)显著激活，脑组织中Claudin-5和Cadherin-5表达显著增加，内源性IgG抗体通过微血管向脑实质渗漏减少。然而，LIPC对Nrf2基因敲除小鼠的BBB无保护作用，表明Nrf2在LIPC介导的BBB保护中起关键作用。此外，Kim等[7]研究发现，LIPC可增强缺血脑的突触可塑性、促进紧密连接蛋白Claudin-5和occludin的表达、加强轴突生长及髓鞘修复。紧密连接蛋白Claudin-5和occludin表达上调有助于脑新生血管形成，降低缺血后BBB的通透性[8]。由此可见，LIPC可在一定程度保护BBB免受缺血性损伤，还可促进其损伤后修复。

2 LIPC与一氧化氮合酶

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)包括内皮型一氧化氮合酶、神经型一氧化氮合酶和诱导型一氧化氮合酶三种亚型。张业贵等[9]研究发现，电针刺激预处理大鼠百会穴和大椎穴可显著降低脑组织神经型NOS和诱导型NOS的表达水平及神经功能缺损评分，提高大脑缺血性损伤后皮层存活神经元数目和胶质纤维酸性蛋白表达水平。Wang等[10]研究表明，LIPC可显著提高大鼠6 min全脑缺血后海马CA1区锥体神经元存活率，还可促进钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ下游的突触支架蛋白PSD95与内皮型一氧化氮合酶结合，促进内皮型一氧化氮合酶Ser847磷酸化，从而降低内皮型一氧化氮合酶活性，阻断c-Jun磷酸化和Fas配体表达，发挥对神经元的保护作用。Greco等[11]向大鼠腹腔内注射内皮型NOS的相对选择性抑制剂L-亚氨基乙基鸟氨酸或非选择性NOS抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯，15 min后将直径0.37 mm的尼龙丝插入右侧大脑中动脉起始处，1 h后拔出以构建缺血模型。该研究发现L-亚氨基乙基鸟氨酸可加重脑皮质损伤，皮质和纹状体中白细胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)的mRNA水平升高，而亚硝基左旋精氨酸甲酯可减少脑皮质损伤，不影响纹状体和皮质中IL-6和TNF-α mRNA的表达，仅增加纹状体RAGE mRNA的表达。以上研究表明，LIPC的脑保护效应与NOS活性下调有关，NOS相关信号通路是脑缺血性疾病的潜在治疗靶点。

3 LIPC与谷氨酸转运体-1

大脑发生缺血性损伤后，谷氨酸(glutamic acid, Glu)在细胞外间隙不断积聚。高水平的Glu可致兴奋性毒性神经元死亡，进一步加剧脑损伤。LIPC可上调胶质细胞谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1, GLT-1)的表达，促进Glu清除，因此具有神经保护作用[12]。Zhao等[13]研究发现，LIPC可显著上调大鼠脑组织p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和GLT-1的表达，增加Glu摄取活性，有效预防8 min全脑缺血后海马CA1区锥体神经元迟发性死亡。此外，p38 MAPK抑制剂SB203580和p38 MAPK反义寡核苷酸可抑制LIPC后海马CA1区GLT-1上调，显著增加海马CA1区神经元丢失或固缩死亡，表明p38 MAPK的表达上调与GLT-1的神经保护作用密切相关。Zhang等[14]研究表明，LIPC可增强星形胶质细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)和GLT-1的表达，减轻致命性脑缺血后海马神经元损伤。免疫印迹和免疫荧光检测结果表明，LIPC后星形胶质细胞中PPARγ激活早于GLT-1上调。此外，PPARγ拮抗剂T0070907可显著降低LIPC诱导的GLT-1上调及相关神经保护作用，表明PPARγ参与了LIPC诱导IT过程中GLT-1的调控。Sun等[15]研究发现，LIPC可促进大鼠海马CA1区核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB) p50蛋白核转位，促进p50/p65二聚体形成，提高NF-κB与DNA的结合活性，最终促进GLT-1表达，减轻缺血性损伤后海马CA1区神经元坏死。此外，应用p38 MAPK抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂BAY11-7082预处理可消除LIPC的上述效应，提示LIPC是通过p38 MAPK/NF-κB分子信号通路上调GLT-1的表达，从而促进Glu清除，最终防止脑缺血后兴奋性毒性神经元死亡。

4 LIPC与免疫调节

脑缺血后大量炎性细胞被招募至梗死区，进而参与脑炎性损伤过程。在大鼠局灶性脑缺血模型中，LIPC可显著抑制缺血后大脑半球细胞因子、趋化因子、黏附分子和促炎转录因子等炎症基因的表达，并阻止中性粒细胞和巨噬细胞向同侧皮质浸润[16]。Pan等[17]研究表明，LIPC可缩小小鼠永久性大脑中动脉闭塞后大脑半球梗死体积，促进离体星形胶质细胞Toll样受体3(toll-likereceptor 3, TLR3)、p-NF-κB及干扰素β(interferon β，IFN-β)表达，减少IL-6分泌，还可提高离体星形胶质细胞在12 h持续性氧糖剥夺后的存活率。此外，TLR3配体Poly I: C预处理同样可促进星形胶质细胞IFN-β的表达，减轻离体星形胶质细胞损伤，而TLR3抗体可抑制IFN-β表达，逆转LIPC和Poly I: C诱导的神经保护效应，表明TLR3信号通路激活可抑制缺血后炎症反应，在LIPC诱导的IT过程中起重要作用。Hamner等[18]研究表明，LIPC可减轻氧糖剥夺对小鼠视神经少突胶质细胞的损伤及轴突完整性的破坏，促进视神经功能恢复。然而，LIPC在TLR4和I型干扰素受体基因敲除的小鼠中均未能诱导脑IT，证明LIPC诱导的神经保护作用依赖于免疫信号分子TLR4和I型干扰素受体的表达。

5 LIPC与遗传调控

5.1 表观遗传修饰

表观遗传修饰指在不改变潜在DNA序列的前提下基因表达调节的全过程，如组蛋白修饰、DNA甲基化和非编码RNA的转录[19]。在局灶性缺血模型中，抑制DNA甲基转移酶、组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶具有神经保护作用已被证实[20]。Cai等[21]将涂有硅树脂的单丝依次通过C57雄性小鼠的右侧颈外及颈内动脉直至到达大脑中动脉底部，然后闭塞右侧大脑中动脉15 min以诱导IT，RNA序列分析、蛋白质检查及DNA甲基化分析表明，脑LIPC后大量神经保护基因的调节区域发生去甲基化且基因表达和蛋白质合成启动，其中Arid5a、Stc2和Nptx2被确定为LIPC的诱导基因，它们在调节区去甲基化后表达上调并发挥神经保护功能。

小泛素样修饰物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)是一种参与翻译后蛋白修饰的泛素样蛋白，可在热应激、缺氧和冬眠等条件下激活并发挥神经保护作用。SUMO化修饰可促进DNA末端运动，并直接影响蛋白质稳定性、先天免疫与I型干扰素的信号通路转导、DNA转录及损伤修复过程[22-23]。敲除SUMO 1基因可加重缺血损伤，沉默SUMO 1可促进Na+/Ca2+交换器亚型3降解，降低LIPC的保护作用[24]。Na+/Ca2+交换器亚型与离子通道、受体和其他离子转运蛋白具有协同作用，Na+和Ca2+稳态对维护线粒体功能、细胞离子稳态及减轻缺血性神经元损伤具有关键作用。因此，Na+/Ca2+交换器亚型3的SUMO化修饰可能是LIPC诱导的脑保护新靶点。

5.2 转录调控

激活蛋白-1(activator protein 1, AP-1)是一种可诱导的转录因子，其与靶基因启动子区域中的特定识别序列结合后参与基因转录调控[25]。Kapinya等[26]研究发现，LIPC可预防沙土鼠5 min全脑缺血后海马CA1区延迟性神经元死亡。此外，运用电泳迁移率变动分析法研究海马CA1神经元AP-1转录因子复合物与DNA的结合活性变化，发现AP-1与DNA的结合活性在LIPC 1～3 h后呈线性增加，3 h出现短暂高峰，提示AP-1的早期激活参与了LIPC诱导的神经保护作用。Formisano等[27]研究发现，氧糖剥夺预处理可提高皮质神经元细胞3 h持续氧糖剥夺后的存活率，并可促进Na+/Ca2+交换器亚型1的表达。此外，研究还发现转录因子家族特异性蛋白1(specificity protein 1, Sp1)是Na+/Ca2+交换器亚型1基因的转录激活子，转录因子家族Sp3是Na+/Ca2+交换器亚型1的转录抑制因子。离体神经元细胞进行氧糖剥夺预处理后，转录因子家族Sp1、缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible facter-1, HIF-1)与组蛋白乙酰转移酶p300共定位在Na+/Ca2+交换器亚型1基因的启动子上，参与Na+/Ca2+交换器亚型1基因的转录调控。Xie等[28]用端粒酶逆转录酶抑制剂BIBR1532对离体神经元进行预处理，随后对离体神经元进行缺氧缺糖处理，发现BIBR1532预处理可显著增强端粒酶逆转录酶与线粒体抗氧化基因启动子结合，促进线粒体抗氧化基因的表达，显著降低活性氧水平，增强神经元对严重缺血缺氧诱导的线粒体氧化应激的耐受性，提高离体神经元缺氧缺糖后的存活率。该研究结果表明，BIBR1532可通过端粒酶逆转录酶介导的转录重编程上调线粒体抗氧化基因的表达，改善脑缺血及氧化应激诱导的神经损伤。

6 LIPC与细胞能量代谢

LIPC可抑制缺血后糖酵解、ATP合成及能量消耗，减轻神经元细胞损伤。Geng等[29]研究发现，LIPC可缩小脑缺血性损伤后梗死面积，改善细胞肿胀、核固缩和脑软化等病理变化，降低神经功能缺损评分；代谢组学分析表明LIPC可抑制缺血后糖酵解，增加磷酸戊糖途径流量并促进β-羟丁酸的利用。此外，代谢关键基因和蛋白质表达分析显示，葡萄糖转运蛋白-1和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3表达下调及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亚单位mRNA水平下降与LIPC诱导的代谢改变有关。Cho等[30]研究表明，LIPC显著减少了大鼠全脑缺血5 min后海马CA1区锥体层神经元细胞死亡。此外，免疫组织化学染色显示沙土鼠CA1区神经元葡萄糖激酶和葡萄糖激酶调节蛋白的免疫反应性在LIPC后显著增强，提示LIPC后CA1区神经元的存活可能与葡萄糖激酶和葡萄糖激酶调节蛋白的表达有关。Baranovicova等[31]闭塞大鼠双侧颈总动脉5 min进行LIPC，48 h后闭塞双侧颈总动脉15 min诱导缺血性损伤，再灌注24 min后血浆代谢物水平分析表明，LIPC组大鼠与缺血性损伤组大鼠的血浆酮体和葡萄糖水平均升高，糖酵解产物水平均降低，两者无显著差异，而LIPC组大鼠血浆肌酸水平显著高于缺血性损伤组，提示LIPC通过增加肌酸水平促进缺血性损伤后的代谢恢复。以上研究表明，深入研究LIPC中调控能量代谢相关的酶及信号通路可能有助于寻找缺血性卒中治疗的潜在分子靶点。

7 展望

在复杂的脑血管手术中，LIPC易操作且具有较好的神经保护作用，但伦理及安全因素限制了其临床应用。因此，进一步探索和优化缺血预处理策略十分必要。药物交叉预处理策略具有耐受性好、创伤较小、有效且易于实施等优点，因此具有广阔的应用前景。进一步研究LIPC脑保护作用的分子机制可为交叉预处理相关脑保护药物的研发和应用夯实基础。此外，目前停循环术后患者的脑永久性和暂时性神经功能障碍发生率仍然较高，术中脑缺血可能是主要原因，将优化的缺血预处理策略与深低温停循环相结合应用到动物实验甚至临床中是一个新的研究方向，有望进一步降低停循环术后神经功能障碍的发生率，提高患者生活质量。