茯苓多糖对2型糖尿病大鼠丝裂原激活的蛋白激酶通路及胰岛素抵抗的影响

李乔，张博

作者单位：中国中医科学院广安门医院南区内分泌科，北京 102618

胰岛素是体内唯一可降血糖的激素，胰岛素抵抗（IR）是指胰岛素促进葡糖摄取和利用率下降，导致机体代偿性分泌过多，是2型糖尿病（T2DM）发病过程的中心环节，但关于IR发生机制尚不明确［1-2］。临床常用二甲双胍（MET）及噻唑烷二酮类等药物改善IR和降低血糖［3-4］。近来研究显示，一些中药可明显改善IR，茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，单独或与其他草药联合使用，具有抗肿瘤、抗病毒和抗氧化应激等作用，可用于治疗糖尿病及癌症等，其有效成分为茯苓多糖（PAC）［5-6］，但关于PAC对T2DM IR的影响尚鲜有研究。因此2019年3—10月，本研究拟初步探究PAC对IR的影响及可能机制，以期为临床IR治疗研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF雄性SD大鼠，周龄范围7~8周，体质量范围200~220 g，购自南京君科生物工程有限公司（动物合格证号110322211100491580）。所有大鼠饲养在中国中医科学院中药研究所［SYXK（京）2020-0042］，于12 h/12 h光照/黑暗循环、温度（23±1）℃、湿度为45%~55%的空调房间内进行常规饲料喂养，自由饮水。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2 药品与试剂PAC（货号SP8930，纯度≥90.0%）购自北京索莱宝科技有限公司，盐酸二甲双胍肠溶胶囊（批号H20103017）购自北京协和药厂；链脲佐菌素（STZ）（货号111607-200301），纯度>98%，购自Sigma公司；兔源一抗anti-磷酸化p38丝裂原激活的蛋白激酶（p-p38MAPK）（货号PA5-110135）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）（货号44-682G）、anti-JNK（货号44-690G），鼠源anti-p38 MAPK（货号AHO1202）、anti-GAPDH抗体（货号AM4300），二抗羊抗鼠IgG（批号B-2752）、羊抗兔IgG（A32731）均 购自美 国Invitrogen公 司。日立7600全自动生化仪；雅培安妥Optium Xceed血糖/血酮仪；MODEL550酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组 参照Barrière等［7］文献方法采用高脂饲料结合腹腔注射STZ（65 mg/kg）制备T2DM大鼠模型，1周后尾静脉采血测得空腹血糖≥16.7 mmol/L、体质量无明显降低者为模型成功。按照随机数字表法分为五组：T2DM组（灌胃等量生理盐水）、二甲双胍（MET）（0.65 mg·kg-1·d-1）组、PAC低（PAC-L，0.05 mg·kg-1·d-1）、中（PAC-M，0.10 mg·kg-1·d-1）、高剂量（PAC-H，0.20 mg·kg-1·d-1）组［8］，每组12只。另取12只正常喂养非T2DM大鼠为正常对组（NC组，灌胃等量生理盐水），干预8周。给药结束后，处死各组大鼠，腹主动脉采血，分离血清；另取肝脏组织置于液氮中保存备用。

1.2.2 血清生化指标检测 采用全自动生化仪检测各组大鼠空腹血糖、血清三酰甘油含量，采用放射性免疫法检测空腹血清胰岛素（FINS）含量，并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IRI）及胰岛素敏感指数（ISI），其中HOMA-IRI=空腹血糖×FINS/22.5，ISI=1/（空腹血糖×FINS）。

1.2.3 肝脏氧化应激指标水平检测 制备各组小鼠肝脏组织匀浆上清液，采用比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛活性，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 肝脏组织MAPK通路相关及其磷酸化蛋白表达水平检测 采用蛋白印迹法检测各组大鼠肝脏组织中p-p38MAPK、p-JNK蛋白表达。取适量提取的各组大鼠肝脏组织总蛋白样品进行SDS-PAGE电泳变性，转至PVDF膜，脱脂奶粉封闭，依次添加一抗anti-p-p38 MAPK（稀释比1∶1 000）、p38 MAPK（稀释比1∶1 000）、anti-p-JNK（稀释比1∶1 000）、an⁃ti-GAPDH（稀释比1∶500）4℃孵育过夜，添加二抗IgG（稀释比1∶5 000）室温孵育1 h，显色、曝片，用Image J软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步多组间的两两比较采用SNKq检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PAC对T2DM大鼠血清生化指标的影响与NC组比较，T2DM组大鼠血清空腹血糖、FINS、三酰甘油含量显著升高（P<0.05）；与T2DM组比较，MET组大鼠血清空腹血糖、FINS、三酰甘油含量显著降低（P<0.05），PAC-L组、PAC-M组、PAC-H组大鼠血清空腹血糖、FINS、三酰甘油含量显著降低，且呈剂量依赖性（P<0.05），其中PAC-M组优于MET组（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清生化指标含量的比较/（mmol/L，±s）

表1 各组大鼠血清生化指标含量的比较/（mmol/L，±s）

注：FINS为空腹血清胰岛素。①与NC组比较，P<0.05。②与T2DM组比较，P<0.05。③与MET组比较，P<0.05。④与PAC-L组比较，P<0.05。⑤与PAC-M组比较，P<0.05。

组别NC组T2DM组MET组PAC-L组PAC-M组PAC-H组F值P值鼠数12 12 12 12 12 12空腹血糖5.08±0.29 12.35±1.27①7.49±0.52①②7.54±0.53①②6.71±0.49①②③④5.93±0.36②③④⑤178.59<0.001 FINS 25.61±3.17 95.48±9.82①86.59±8.32①②88.37±8.25①②71.28±7.03①②③④56.93±4.89①②③④⑤154.48<0.001三酰甘油0.64±0.07 1.69±0.24①1.39±0.14①②1.43±0.13①②1.13±0.11①②③④0.92±0.08①②③④⑤88.97<0.001

2.2 PAC对T2DM大鼠胰岛素敏感性的影响与NC组比较，T2DM组大鼠HOMA-IRI水平显著升高，ISI水平显著降低（P<0.05）；与T2DM组比较，MET组大鼠HOMA-IRI水平降低，ISI水平显著升高（P<0.05），PAC-L组、PAC-M组、PAC-H组大鼠HOMAIRI水平降低，ISI水平显著升高，且呈剂量依赖性（P<0.05）。其中PAC-M组优于MET组（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠胰岛素敏感性的比较/±s

表2 各组大鼠胰岛素敏感性的比较/±s

注：HOMA-IRI为胰岛素抵抗指数，ISI为胰岛素敏感指数。①与NC组比较，P<0.05。②与T2DM组比较，P<0.05。③与MET组比较，P<0.05。④与PAC-L组比较，P<0.05。⑤与PAC-M组比较，P<0.05。

组别NC组T2DM组MET组PAC-L组PAC-M组PAC-H组F值P值鼠数12 12 12 12 12 12 HOMA-IRI 5.81±1.05 62.56±5.11①47.73±4.42①②49.47±4.56①②31.14±3.03①②③④26.59±2.16①②③④⑤360.78<0.001 ISI/×10-3 7.69±0.14 0.86±0.05①1.53±0.09①②1.51±0.11①②2.14±0.12①②③④3.73±0.15①②③④⑤5 851.02<0.001

2.3 PAC对T2DM大鼠肝组织氧化应激的影响与NC组比较，T2DM组大鼠肝脏组织GSH-Px、SOD活性降低，丙二醛含量升高（P<0.05）；与T2DM组比较，MET组大鼠肝脏组织GSH-Px、SOD活性升高，丙二醛含量降低（P<0.05），PAC-L组、PAC-M组、PACH组大鼠肝脏组织GSH-Px、SOD活性升高，丙二醛含量降低，且呈剂量依赖性（P<0.05）。其中PAC-H组优于MET组（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠氧化应激指标水平的比较/±s

表3 各组大鼠氧化应激指标水平的比较/±s

注：GSH-Px为谷胱甘肽过氧化物酶，SOD为超氧化物歧化酶。①与NC组比较，P<0.05。②与T2DM组比较，P<0.05。③与MET组比较，P<0.05。④与PAC-L组，P<0.05。⑤与PAC-M组，P<0.05。

组别NC组T2DM组MET组PAC-L组PAC-M组PAC-H组F值P值鼠数12 12 12 12 12 12 GSH-Px/（U/mg）85.21±8.36 38.65±4.23①52.06±5.21①②45.57±4.48①②51.14±5.02①②③④63.78±5.86①②③④⑤100.87<0.001 SOD/（U/mg）65.87±5.52 35.29±3.15①56.02±4.32①②43.27±8.25①②54.58±4.05①②③④59.23±4.14②③④⑤55.76<0.001丙二醛/（μmol/g）7.04±1.05 13.39±1.16①8.57±1.14①②10.92±1.23①②8.69±1.15①②③④7.32±1.16②③④⑤53.18<0.001

2.4 PAC对T2DM大鼠肝组织MAPK通路相关蛋白表达的影响与NC组比较，T2DM组大鼠肝脏组织p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平显著升高（P<0.05）；与T2DM组比较，MET组大鼠肝脏组织p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平显著降低（P<0.05），PAC-L组、PACM组、PAC-H组大鼠肝脏组织p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平降低，且呈剂量依赖性（P<0.05）。其中PACM组优于MET组（P<0.05）。见图1，表4。

图1 蛋白质印迹法检测各组大鼠肝脏组织p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平的表达

表4 各组大鼠肝脏组织p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平的比较/±s

表4 各组大鼠肝脏组织p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平的比较/±s

注：p-p38MAPK为磷酸化p38丝裂原激活的蛋白激酶，p-JNK为磷酸化c-Jun氨基末端激酶。①与NC组比较，P<0.05。②与T2DM组比较，P<0.05。③与MET组比较，P<0.05。④与PAC-L组，P<0.05。⑤与PAC-M组，P<0.05。

组别NC组T2DM组MET组PAC-L组PAC-M组PAC-H组F值P值鼠数12 12 12 12 12 12 p-p38MAPK 0.16±0.03 1.35±0.08①0.87±0.04①②1.04±0.06①②0.89±0.03①②③④0.39±0.02①②③④⑤990.40<0.001 p-JNK 0.17±0.02 1.29±0.08①0.74±0.04①②0.85±0.02①②0.72±0.05①②③④0.31±0.01①②③④⑤1 014.57<0.001

3 讨论

茯苓是我国常用中草药，性平，味甘淡，据《神农百草经》记载其“主胸膈逆气，利小便，久服安魂补神，不饥延年”［9］，现代药理学研究表明，PAC是其最主要活性成分，具有降血糖和抗脂质过氧化等作用［10-11］。Chen等［12］研究报道，茯苓可配伍甘草、柑桔、陈皮、半夏、竹节组成温胆汤，经多途径、多通路治疗代谢综合征。黄聪亮等［13］研究报道，PAC可有效降低T2DM小鼠血糖、血清胰岛素及血脂水平，改善T2DM引起的脂质代谢紊乱。本研究采用高脂喂养SD大鼠结合注射STZ建立T2DM大鼠IR模型，与NC组比较，T2DM组大鼠血清空腹血糖、FINS、三酰甘油含量及HOMA-IRI水平显著升高，ISI水平显著降低，符合T2DM基本特征及IR临床特点，提示造模成功。与T2DM组比较，PAC呈剂量依赖性降低空腹血糖、FINS、三酰甘油含量、HOMA-IRI水平，升高ISI水平，提示PAC可能对T2DM大鼠IR具有显著改善作用。

IR是T2DM疾病发生过程中重要特征。肝脏是调节糖、脂代谢等能量调节的主要器官，肝脏IR在机体IR中占重要地位。本研究结果发现，与NC组比较，T2DM组大鼠肝脏组织GSH-Px、SOD活性降低，丙二醛含量升高；与T2DM组比较，PAC可呈剂量依赖性升高大鼠肝脏组织GSH-Px、SOD活性，降低丙二醛含量，提示在IR可引起机体氧化应激，破坏氧化与抗氧化动态平衡，而PCA可调节二者平衡，具有抗氧化应激、改善IR作用，与文献报道一致［14-15］。

肝细胞胰岛素信号转导通路涉及环节众多，其中以MAPK通路、PI3K通路等研究居多。MAPK可分为细胞外信号调节激酶（ERK）、p38、JNK和ERK5 4个亚族，其中p38 MAPK是一种重要应激信号传导蛋白，可被高脂、高糖等多种内源性及（或）外源性信号分子激活［16］，抑制p38 MAPK信号转导途径可减轻氧化应激，改善高脂诱导的T2DM小鼠IR［3］。JNK可广泛参与细胞分化和凋亡、胚胎发育、免疫反应及IR等多种生理病理过程［17-18］，下调JNK表达可改善IR［19］。本研究结果发现，与NC组比较，T2DM组大鼠肝脏组织p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平显著升高；与T2DM组比较，PAC可呈剂量依赖性降低大鼠肝脏组织p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平，提示PAC可能通过抑制MAPK通路激活，减轻T2DM氧化应激，改善胰岛素抵抗。

综上所述，PAC可改善T2DM大鼠胰岛素抵抗，该作用可能与其抑制MAPK/p38MAPK、MAPK/JNK通路，减轻氧化应激有关。但关于PAC改善胰岛素抵抗的作用过程是否涉及其他代谢通路，有待进一步深入探究。