芍药苷通过激活LKB1/AMPK 信号通路对急性脑梗死大鼠神经损伤的保护作用

2022-11-21赵霞薛娣师少军

中国实验动物学报 2022年5期

赵霞,薛娣,师少军

(1.南阳医学高等专科学校,河南南阳 473000;2.河南省安阳市中医院神经外科,河南安阳 455000)

急性脑梗死(acute cerebral infarction,ACI)是一种常发生于中老龄人群的脑血管疾病,发病率高,病情进展快,治愈困难,可导致偏瘫、认知功能障碍等后遗症,是我国主要的致死、致残疾病之一[1-2]。ACI 发病机制复杂,抗炎因子和致炎因子表达失衡引发的炎症在其中发挥着重要作用,研究显示,抑制炎症,降低氧化应激水平,可减轻缺血再灌注脑组织损伤,改善ACI 引发的神经功能障碍[3-4]。

芍药苷是从芍药中提取的活性成分,具有抗炎、抗过敏、抗氧化及改善认知等多种生物学效应,可通过抑制NLRP3 炎症小体信号激活而减轻脑缺血再灌注损伤[5],还可激活SIRT1/NF-κB 信号通路,改善缺氧缺血性脑损伤新生大鼠认知功能[6],是治疗ACI 的一种重要药物,但其治疗ACI 的机制还未有具体定论。肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)/ 5’-磷酸腺苷激活的蛋白激酶(5’-amp activated protein kinase,AMPK)是调控脂质代谢、氧化应激和炎症的重要通路。上调SIRT1 表达,可激活LKB1/AMPK 信号通路,显著减轻氧化应激损伤,抑制脂质合成[7-8],还可通过减轻炎症、氧化应激和神经细胞凋亡来改善ACI 引发的脑损伤[9]。因而推测激活LKB1/AMPK 信号通路可能是芍药苷治疗ACI 的药理机制。本文以线栓闭塞大鼠大脑中动脉的方法建立ACI 模型,探讨芍药苷通过激活LKB1/AMPK 信号通路对其神经损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 主要试剂与仪器

芍药苷(纯度 ≥ 98%,货号VTY31585),购于北京德航五洲科技有限公司;AMPK 的抑制剂Compound C(CC)(货号HY-13418A),购于美国MedChemExpress 公司; 三苯基氯化四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride,TTC)(货号T8170)、高效RIPA 裂解液(货号R0010)、TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(货号T2190),购于北京索莱宝科技有限公司;大鼠诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 试剂盒(货号SBJ-R00),购于上海木栾科技有限公司;白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)测试盒(货号H002)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)测定试剂盒(货号E004-1-1),购于南京建成生物工程研究所有限公司;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)检测试剂盒(货号ab238537)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性测定试剂盒(货号ab83464)、BCA 蛋白检测试剂盒(货号ab102536)、兔源Anti-B 淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2) 一抗(货号ab194583)、兔源Anti-β-actin 一抗(货号ab8227)、羊抗兔二抗(货号ab150077)、兔源Anti-BCL2 相关X 蛋白(BCL2-associated X protein,Bax)一抗(货号ab32503),购于美国Abcam 公司;兔源Anti-LKB1 一抗(货号AF7389)、兔源Anti-p-AMPK 一抗(货号AF5908)、兔源Anti-AMPK 一抗(货号AF6195),购于上海碧云天生物技术有限公司;兔源Anti-p-LKB1 一抗(货号sc-271924)购于美国Santa Cruz Biotechnology 公司等。

MG-3Y 迷宫刺激器,成都泰盟科技有限公司产品;Morris 水迷宫,购自安徽正华生物仪器设备有限公司; 自动酶标仪购于美国伯腾公司, 型号2010ELX-808;包埋机、倒置光学显微镜、切片机购于德国 Leica 公司, 型号 EG1160、 DMI3000B、CM3050S;高通量垂直电泳仪、转印电泳仪购于北京六一生物科技有限公司,型号DYCZ-20H、DYCZ-40K;蛋白凝胶成像仪购于美国Bio-Rad 公司,型号170-8200 等。

1.2 方法

1.2.1 ACI 大鼠模型制备及分组给药

参照文献制备ACI 大鼠模型[10]:大鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射45 mg/kg 戊巴比妥钠,待大鼠进入深度麻醉状态后仰卧固定,颈部备皮消毒后切开皮肤、肌肉组织,找到颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉,将其游离,永久结扎颈外动脉远心端,暂时夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉远心端,于距离分叉处2 mm 的颈外动脉处作切口,插入圆头线栓,沿颈内动脉前进至圆头端距离分叉处约16 mm 为止,2 h后取出线栓,恢复供血,即完成造模,将其随机分为模型组、芍药苷组、CC 组、芍药苷 + CC 组,每组12只,另取12 只大鼠仅分离出颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉,不插线栓,作为假手术组。

按照“平战一体、专司主营”的原则，各级装备保障部门要加快理顺领导指挥关系。平时，军以上装备保障部门应以核心骨干力量为主，领导组织部队的装备采购、管理、维护以及供应等工作；军以下联勤保障部门要主动适应新体制架构，实现联勤保障部门内部各级与相同职能的军以上装备部门的业务衔接。战时，军以上装备部门应以装备保障指挥机关的角色纳入一体化联合指挥部，指挥协调装备保障行动；军以下联勤保障部门应根据战区联指的指令，迅速进入战时装备保障指挥模式。各级装备保障机构平时应按照“常态运行、精干高效”的原则要求，简化装备保障组织实施流程，以便战时能够快速释放装备保障效能。

将芍药苷与CC 分别溶于0.9%氯化钠溶液,获得1 mg/mL 的芍药苷药液[10],0.02 mg/mL 的CC药液[11],芍药苷 + CC 组大鼠以10 mL/kg 剂量的芍药苷药液每天灌胃干预1 次,同时以10 mL/kg 剂量的CC 药液每天尾静脉注射干预1 次;芍药苷组大鼠以10 mL/kg 剂量的芍药苷药液每天灌胃干预1次,同时以10 mL/kg 剂量的0.9%氯化钠溶液每天尾静脉注射干预1 次;CC 组大鼠以10 mL/kg 剂量的0.9%氯化钠溶液每天灌胃干预1 次,同时以10 mL/kg 剂量的CC 药液每天尾静脉注射干预1 次,共给药14 d。假手术组与模型组在相应位置注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 检测大鼠认知功能

药物干预结束后24 h,通过Morris 水迷宫实验检测大鼠认知功能:将大鼠面朝水池(水深22 cm,有4 个等大的象限)壁放入水中,训练其寻找平台(位于象限正中,高20 cm),5 d 后撤去平台,将大鼠自每个象限面朝水池壁依次放入水中,记录其60 s内运动轨迹,分析得到各组大鼠跨越原平台次数及原平台象限内停留时间[12]。

1.2.3 检测大鼠脑梗死情况及标本收集

Morris 水迷宫实验结束后,以1.2.1 中的方法麻醉大鼠,自颈总动脉抽血,静置离心,取出上清,放置于干净EP 管中分组标记,在-80℃保存。各组大鼠中任意选出6 只,断头后分离出大脑,切片得到厚度大致相同的冠状切片,将其浸没入TTC 溶液中染色,然后固定、拍照,使用Image pro 软件进行图像分析,计算出脑梗死面积(%)=全脑梗死面积/全脑片面积 × 100%。将各组剩余的6 只大鼠断头分离出大脑后,剪下1.2 g 脑组织,剪成小碎块后加入适量高效RIPA 裂解液,匀浆离心,以BCA 试剂盒测量上清中蛋白总浓度后,将其分组标记,在-80℃保存;剩余脑组织漂洗、固定、脱水后,以仪器进行包埋、切片备用。

1.2.4 检测大鼠海马神经元凋亡情况

选出1.2.3 中含有完整海马结构的脑组织切片,进行脱蜡、水化、TUNEL 染色、脱水、透明、封片,镜下观察着色情况,以Image pro 软件分析图像,计算出凋亡率(%)= 凋亡细胞数/总细胞数 × 100%,具体操作参照试剂盒说明书指导进行。

1.2.5 检测大鼠血清iNOS 与IL-1β 水平、脑组织CAT、ROS 与MDA 含量

取出1.2.3 中血清与脑组织蛋白样品液,以冰水浴缓慢解冻,各取出0.15 mL,测定血清iNOS 与IL-1β 水平、脑组织CAT、ROS 与MDA 含量,具体操作参照试剂盒说明书指导进行。

1.2.6 检测大鼠脑组织凋亡蛋白与LKB1/AMPK通路相关蛋白表达

取出1.2.5 中剩余的脑组织蛋白样品液,根据蛋白浓度测定结果将其调至各组相等,然后加入适量上样缓冲液,变性蛋白(煮沸,5 min),取20 μL 样品液,依次通过电泳、湿转实验,将总蛋白分离后转至PVDF 膜上,以3%牛血清白蛋白溶液封闭蛋白非特异位点,分别以兔源Bcl-2、Bax、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、β-actin 一抗孵育、TBST 洗膜、二抗孵育、TBST 洗膜、化学发光法显影、拍照,使用Image pro 软件分析蛋白条带图像灰度值,计算出各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠认知功能检测结果

与假手术组相比,模型组大鼠跨越原平台次数、原平台象限内停留时间显著降低(P＜ 0.05)。与模型组、芍药苷 + CC 组分别相比,芍药苷组大鼠跨越原平台次数、原平台象限内停留时间均显著升高(P＜ 0.05),CC 组大鼠跨越原平台次数、原平台象限内停留时间均显著降低(P＜ 0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠跨越原平台次数、原平台象限内停留时间比较(±s,n = 12)Table 1 Comparison of times of crossing the original platform and residence time in the original platform quadrant of rats in each group (±s, n = 12)

注:与假手术组相比,aP ＜ 0.05;与模型组相比,bP ＜ 0.05;与芍药苷+ CC 组相比,cP ＜ 0.05。 (下表同)Note. Compared with sham operation group, aP ＜ 0.05. Compared with model group, bP ＜ 0.05. Compared with paeoniflorin + CC group, cP ＜0.05.(The same in the following tables)

组别Groups跨越原平台次数(n)Times of crossing the original platform(n)原平台象限内停留时间(s)Dwell time in quadrant of original platform(s)假手术组Sham operation group 13.01 ± 3.12 34.76 ± 4.07模型组Model group 6.28 ± 0.54a 21.93 ± 2.02a芍药苷组Paeoniflorin group 8.26 ± 1.22bc 26.54 ± 2.75bc CC 组CC group 1.02 ± 0.11bc 7.01 ± 1.63bc芍药苷 + CC 组Paeoniflorin + CC group 6.79 ± 0.68 23.04 ± 2.28

2.2 各组大鼠脑梗死情况检测结果

与假手术组相比,模型组大鼠脑梗死面积显著升高(P＜ 0.05)。与模型组、芍药苷 + CC 组分别相比,芍药苷组大鼠脑梗死面积均显著降低(P＜0.05);CC 组大鼠脑梗死面积均显著升高(P＜0.05)(见图1、表2)。

表2 各组大鼠脑梗死面积比较(±s,n = 6)Table 2 Comparison of cerebral infarction area of rats in each group(±s, n = 6)

组别Groups脑梗死面积(%)Cerebral infarction area(%)假手术组Sham operation group 0.00 ± 0.00模型组Model group 26.10 ± 1.36a芍药苷组Paeoniflorin group 9.25 ± 0.92bc CC 组CC group 45.32 ± 4.01bc芍药苷 + CC 组Paeoniflorin + CC group 24.86 ± 1.75

2.3 各组大鼠海马神经元凋亡情况检测结果

与假手术组相比,模型组大鼠海马神经元凋亡率显著升高(P＜ 0.05)。与模型组、芍药苷 + CC组分别相比,芍药苷组大鼠海马神经元凋亡率均显著降低(P＜ 0.05);CC 组大鼠海马神经元凋亡率均显著升高(P＜ 0.05)(见图2,表3)。

表3 各组大鼠海马神经元凋亡率比较(±s,n = 6)Table 3 Comparison of apoptosis rate of hippocampal neurons in each group(±s, n = 6)

组别Groups凋亡率(%)Apoptosis rate(%)假手术组Sham operation group 1.20 ± 0.36模型组Model group 26.07 ± 1.25a芍药苷组Paeoniflorin group 5.13 ± 0.86bc CC 组CC group 59.34 ± 5.25bc芍药苷+CC 组Paeoniflorin + CC group 25.78 ± 1.62

2.4 各组大鼠血清炎性因子iNOS 与IL-1β 水平检测结果

与假手术组相比,模型组大鼠血清炎性因子iNOS 与IL-1β 水平显著升高(P＜ 0.05)。与模型组、芍药苷+CC 组分别相比,芍药苷组大鼠血清炎性因子iNOS 与IL-1β 水平均显著降低(P＜ 0.05);CC 组大鼠血清炎性因子iNOS 与IL-1β 水平均显著升高(P＜ 0.05)(见表4)。

表4 各组大鼠血清炎性因子iNOS 与IL-1β 水平比较结果(±s,n = 12)Table 4 Serum inflammatory factors iNOS and IL-1 of rats in each group β Horizontal comparison results(±s, n = 12)

组别Groups iNOS(U/mL)IL-1β(pg/mL)假手术组Sham operation group 15.16 ± 3.25 62.43 ± 5.89模型组Model group 67.43 ± 8.09a 117.39 ± 10.54a芍药苷组Paeoniflorin group 17.08 ± 3.56bc 64.28 ± 7.21bc CC 组CC group 108.02 ± 10.15bc 168.46 ± 12.96bc芍药苷 + CC 组aeoniflorin + CC group 65.37 ± 8.61 115.25 ± 9.12

2.5 各组大鼠脑组织氧化应激水平检测结果

与假手术组相比,模型组大鼠脑组织CAT 含量显著降低(P＜ 0.05),ROS、MDA 含量显著升高(P＜ 0.05)。与模型组、芍药苷 + CC 组分别相比,芍药苷组大鼠脑组织CAT 含量均显著升高(P＜0.05),ROS、MDA 含量均显著降低(P＜ 0.05);CC组大鼠脑组织CAT 含量均显著降低(P＜ 0.05),ROS、MDA 含量均显著升高(P＜ 0.05)(见表5)。

表5 各组大鼠脑组织CAT、ROS 与MDA 含量比较结果(±s,n = 6)Table 5 Comparison results of cat, ROS and MDA contents in brain tissue of rats in each group(±s, n = 6)

组别Groups CAT(U/mg prot)ROS(U/kg prot)MDA(nmol/mg prot)假手术组Sham operation group 6.59 ± 0.71 0.92 ± 0.21 1.12 ± 0.13模型组Model group 2.65 ± 0.18 6.84 ± 0.67a 3.90 ± 0.35a芍药苷组Paeoniflorin group 6.17 ± 0.83bc 1.14 ± 0.32bc 1.20 ± 0.29bc CC 组CC group 0.68 ± 0.15bc 12.38 ± 2.26bc 6.04 ± 0.41bc芍药苷 + CC 组Paeoniflorin + CC group 2.92 ± 0.39 6.57 ± 0.84 3.71 ± 0.39

2.6 各组大鼠脑组织凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)与LKB1/AMPK 通路相关蛋白(p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK)表达检测结果

与假手术组相比,模型组大鼠脑组织p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK、Bcl-2 表达水平显著降低(P＜ 0.05),Bax 表达水平显著升高(P＜ 0.05)。与模型组相比,芍药苷组大鼠脑组织p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK、Bcl-2 表达水平显著升高(P＜ 0.05),Bax 表达水平显著降低(P＜ 0.05);CC 组大鼠脑组织p-AMPK/AMPK、Bcl-2 表达水平显著降低(P＜0.05),Bax 表达水平显著升高(P＜ 0.05),p-LKB1/LKB1 水平无显著性差异(P＞ 0.05)。与芍药苷 +CC 组相比,芍药苷组大鼠脑组织p-AMPK/AMPK、Bcl-2 表达水平显著升高(P＜ 0.05),Bax 表达水平显著降低(P＜ 0.05),p-LKB1/LKB1 水平无显著性差异(P＞ 0.05);CC 组大鼠脑组织p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK、Bcl-2 表达水平显著降低(P＜ 0.05),Bax 表达水平显著升高(P＜ 0.05)(见图3,表6)。

表6 各组大鼠凋亡相关蛋白与LKB1/AMPK 通路相关蛋白相对表达水平比较(±s,n = 6)Table 6 Comparison of relative expression levels of apoptosis related proteins and LKB1/AMPK pathway related proteins in rats of each group(±s, n = 6)

组别Groups Bcl-2/β-actin Bax/β-actin p-LKB1/LKB1 p-AMPK/AMPK假手术组Sham operation group 1.84 ± 0.37 0.22 ± 0.07 1.31 ± 0.28 1.68 ± 0.33模型组Model group 0.71 ± 0.14a 1.48 ± 0.23a 0.47 ± 0.09a 0.72 ± 0.12a芍药苷组Paeoniflorin group 1.79 ± 0.42bc 0.25 ± 0.08bc 1.26 ± 0.25b 1.64 ± 0.41bc CC 组CC group 0.12 ± 0.03bc 2.13 ± 0.31bc 0.45 ± 0.08c 0.18 ± 0.05bc芍药苷+CC 组Paeoniflorin + CC group 0.74 ± 0.13 1.45 ± 0.29 1.23 ± 0.30 0.76 ± 0.14

3 讨论

ACI 具有高发病率、高病死率、高致残率等特点,我国每年因此而致死致残的人数众多,所花费的金钱、精力、时间给患者家庭带来了沉重的负担,极大降低了患者及其家庭的生活质量,是目前神经临床医学亟需解决的热点和难点问题[13]。线栓法构建的大脑中动脉栓塞模型是常用的模拟动物脑缺血损伤的模型之一,被广泛应用于脑部缺血疾病的研究,可较好类比人脑缺血损伤的病理机制。因此本文以线栓闭塞大鼠大脑中动脉的方法建立急性脑梗死模型,结果显示,造模大鼠脑梗死面积、血清iNOS 与IL-1β 水平、脑组织ROS 与MDA 含量、Bax 表达水平显著升高,导致强烈的炎症及氧化应激,造成大鼠海马神经元凋亡,跨越原平台次数、原平台象限内停留时间降低,学习认知能力受损,提示模型构建成功。

芍药苷作为具有很强抗炎、抗氧化作用的天然活性物质,可抑制NLRP3 炎症小体信号,进而延缓视网膜缺血性损伤[14],还可减少氯化钴诱导的神经细胞PC12 内ROS 水平,降低氧化应激水平,抑制细胞凋亡,并对脑缺血再灌注损伤大鼠起到明显的神经保护作用[5,15],半暗带损伤是脑梗死不良预后的主要原因,其具有可逆性,及时采取药物恢复血流可恢复半暗带损伤。氧自由基增多可能会促进半暗带细胞的凋亡,因此抑制氧自由基的释放,恢复半暗带区域的神经元活力是治疗脑缺血损伤的方法之一。本研究芍药苷处理的ACI 大鼠脑组织脑梗死面积明显减少,ROS 与MDA 含量、海马神经凋亡比例降低,CAT 含量升高,脑梗死面积减少的可能原因是芍药苷清除氧自由基,促进了缺血半暗带的转换,脑梗死面积减少。同时芍药苷处理大鼠跨越原平台次数、原平台象限内停留时间升高,大鼠认知功能提升,证实了芍药苷对ACI 大鼠的疗效。此外芍药苷处理大鼠血清iNOS 与IL-1β 水平降低,表明芍药苷可抑制致炎因子表达,阻碍炎症发生与进展。

脑组织缺血再灌注引发的严重炎症反应和高水平的氧化应激造成神经元细胞变性凋亡,是ACI的主要致病基础,抑制炎症及脂质过氧化是减轻ACI 所致神经损伤的有效手段[16-17]。 LKB1/AMPK作为机体调控炎症与氧化应激反应的重要通路,在脑损伤、阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统疾病的发病及病情进展过程中发挥着关键作用,促进LKB1、AMPK 的磷酸化激活,可通过促进自噬抑制氧-葡萄糖剥夺/复氧诱导的神经细胞PC12 凋亡[18],还可减轻神经炎症,缓解脑缺血再灌注引发的氧化应激损伤,起到神经保护作用[9,19-20]。由此可知,LKB1/AMPK 信号是ACI 的一个重要治疗靶点。本文结果显示,芍药苷干预可阻止ACI 大鼠脑组织p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK 水平的降低,以AMPK 抑制剂CC 处理ACI 大鼠,可加重神经炎症及氧化应激反应,增强脑梗死及海马神经元凋亡,导致大鼠认知功能进一步受损,并可减弱芍药苷改善ACI 大鼠脑损伤的作用,逆转其对大鼠的神经保护功能,表明芍药苷可通过激活LKB1/AMPK信号通路,阻碍氧化应激与炎症反应发生发展,减轻脑梗死及海马神经元凋亡,增强ACI 大鼠认知能力,改善其神经功能。

综上所述,芍药苷可增强LKB1、AMPK 的磷酸化,清除氧自由基,减少炎性细胞因子表达,减轻神经炎症,减弱氧化应激,抑制脑梗死与海马神经元凋亡,修复ACI 大鼠认知功能,起到神经保护作用,促进LKB1/AMPK 信号传导是其药理机制之一。

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