直肠腔内三维超声联合FHIT、Apollon 蛋白对老年直肠癌患者壁外血管侵犯及预后的评估价值

杨勇 何开强 文云波

(遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院)肛肠科，贵州 遵义 563000)

直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，全球每年新发直肠癌病例约600万，发病率和死亡率均位居前列〔1〕。老年人是直肠癌的高发群体，存在较多的基础疾病，加之直肠癌起病隐匿，早期症状不典型，多数患者确诊时已出现远处转移〔2〕。相关研究显示，壁外血管侵犯是直肠癌转移、局部复发、不良预后的独立危险因素〔3〕。术前准确评估直肠癌患者壁外血管侵犯情况对治疗方案的制定具有重要价值。目前临床主要采用磁共振成像进行直肠癌术前壁外血管侵犯的评估，但准确性仍需进一步提升〔4〕。直肠腔内三维超声主要用于评估直肠癌患者的T分期和N分期，评估壁外血管侵犯的相关研究仍十分少见。脆性组氨酸三联体(FHIT)基因在胃癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在异常表达，与肿瘤细胞转移和侵袭相关〔5〕。凋亡抑制蛋白Apollon过表达会促进肿瘤细胞转移，参与肿瘤的发生与发展〔6〕。本研究旨在探讨直肠腔内三维超声联合FHIT、Apollon 蛋白对老年直肠癌患者壁外血管侵犯及预后的评估价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年1～12月遵义医科大学第三附属医院老年直肠癌患者85例。入选标准：①无手术禁忌证，接受直肠癌根治术治疗；②术后病理检查确诊为直肠癌；③术前10 d内行直肠腔内三维超声检测；④术后留取病理标本，随访治疗和临床资料完整。排除标准：①术前有放化疗等抗治疗史；②存在其他部位原发性肿瘤；③精神异常，无法配合随访。其中男50例，女35例；年龄60～81岁，平均(71.56±5.14)岁。本研究经医院伦理委员会审批通过，患者自愿参与并签署知情同意书。

1.2直肠腔内三维超声检查 使用彩色多普勒超声诊断仪进行直肠腔内三维超声检查，腔内3D探头频率分别为6、9、12 MHz。检查前2 h进行肠道准备，患者肠道清洁完成后行侧卧位肛门指检，判断肿瘤病灶的质地、位置、解剖学结构等，使用一次性灌注器皿注入100 ml无菌耦合剂，超声探头保护套后进入肛门至肿瘤病灶位置，观察病变浸润深度、体积大小、周围组织淋巴结个数。三维立体成像后观察肿瘤病灶周围是否有扩张血管或异常走行及血流充盈情况。直肠癌壁外血管侵犯的诊断按照Smith等〔7〕提出的评估标准，0分：非结节状肿瘤侵至肠壁肌层；1分：结节状肿瘤侵出肠壁；2分：肿瘤周边有供血血管，但血管轮廓无异常，且无血管狭窄和扩张，无异常实性信号；3分：肿瘤周围血管中有异常回声，血管轮廓略微扩张，或有轻微血管狭窄和扩张；4分：肿瘤周围血管中有异常回声，血管轮廓不规则扩张。3～4分者需要联合血管内血流充盈情况；0～2分诊断为壁外血管侵犯阴性，3～4分诊断为壁外血管侵犯阳性。

1.3FHIT 和Apollon 蛋白表达检测 收集老年直肠癌患者癌组织和距离肿瘤病灶约3 cm的癌旁组织，均使用10%中性甲醛溶液固定，剪成边长为1 cm的组织块，梯度乙醇脱水，二甲苯固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片。将切片脱蜡至水，热修复抗原，3%过氧化氢孵育后，磷酸缓冲盐溶液洗涤，转入封闭液中封闭。每张切片中均加入鼠抗人FHIT 多克隆抗体(1∶500稀释)，鼠抗人Apollon 多克隆抗体(1∶500稀释)，37℃条件下孵育2 h，滴加生物素标记的山羊抗鼠IgG，1∶2 000稀释，37℃条件下孵育30 min，二氨基联苯胺法显色，苏木精复染，封片后再光学显微镜下观察。高倍镜视野下随机选取切片的5个视野，根据染色强度分为：无色0分、黄色1分、棕黄色2分、褐色3分；根据阳性细胞比例分为：无阳性细胞0分、≤10%及1分、10%～50% 2分、51%～75% 3分、>75% 4分。染色强度与阳性细胞比例乘积≤1为阴性，≥2为阳性。

1.4资料收集及随访观察 收集患者性别、年龄、T分期、N分期、分化程度、癌胚抗原水平及术后病理诊断壁外血管侵犯情况。手术治疗后对患者进行3年随访，采用门诊复查结合电话随访的方式进行，记录患者生存时间。

1.5统计学分析 采用SPSS24.0软件进行Kappa分析、χ2检验、受试者工作特征(ROC)曲线分析和Kaplan-Meier曲线分析。

2 结 果

2.1不同临床病理特征老年直肠癌患者壁外血管侵犯情况比较 不同年龄、T分期、N分期、分化程度、癌胚抗原水平血管侵犯阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 不同临床病理特征老年直肠癌患者壁外血管侵犯情况比较〔n(%)〕

2.2直肠腔内三维超声对老年直肠癌患者壁外血管侵犯的诊断分析 以术后病理结果为诊断血管侵犯的金标准，71例术后病理结果血管侵犯阴性患者中直肠腔内三维超声正确诊断68例，误诊3例；14例术后病理结果血管侵犯阳性患者中直肠腔内三维超声正确诊断10例，误诊4例；直肠腔内三维超声诊断老年直肠癌患者壁外血管侵犯的准确率为91.76%(Kappa=0.752，P=0.005)。

2.3FHIT 蛋白对老年直肠癌患者壁外血管侵犯的诊断分析 71例术后病理结果血管侵犯阴性患者中FHIT 蛋白阴性66例，误诊5例；14例术后病理结果血管侵犯阳性患者中FHIT 蛋白阳性8例，误诊6例；FHIT 蛋白阳性诊断老年直肠癌患者壁外血管侵犯的准确率为87.05%(Kappa=0.692，P=0.010)。

2.4Apollon 蛋白对老年直肠癌患者壁外血管侵犯的诊断分析 71例术后病理结果血管侵犯阴性患者中Apollon蛋白阴性63例，误诊8例；14例术后病理结果血管侵犯阳性患者中Apollon 蛋白阳性8例，误诊6例；Apollon蛋白阳性诊断老年直肠癌患者壁外血管侵犯的准确率为83.53%(Kappa=0.657，P=0.018)。

2.5不同临床病理特征老年直肠癌患者FHIT和Apollon 蛋白阳性表达比较 不同年龄、T分期、N分期、分化程度、癌胚抗原水平FHIT和Apollon蛋白阳性率差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表2。

表2 不同临床病理特征老年直肠癌患者FHIT和Apollon 蛋白阳性表达情况比较〔n(%)〕

2.6直肠腔内三维超声及FHIT、Apollon 蛋白对老年直肠癌患者壁外血管侵犯的诊断效能分析 ROC曲线分析显示，直肠腔内三维超声、FHIT蛋白、Apollon 蛋白单独和联合检测对老年直肠癌患者壁外血管侵犯均具有较高的诊断价值(P<0.05)；其中直肠腔内三维超声及FHIT、Apollon 蛋白联合检测的诊断价值最高(AUC=0.836)，灵敏度明显高于各指标单独检测。见图1、表3。

表3 直肠腔内三维超声及FHIT、Apollon 蛋白对老年直肠癌患者壁外血管侵犯的诊断价值分析

2.7老年直肠癌患者3年生存情况的Kaplan-Meier曲线分析 直肠腔内三维超声、FHIT蛋白、Apollon 蛋白阳性的老年直肠癌患者3年生存率明显低于直肠腔内三维超声、FHIT蛋白、Apollon 蛋白阴性者(Log-rankχ2=13.481、10.635、9.873，均P<0.05)。见图2。

3 讨 论

研究者显示壁内血管与壁外血管区别后，直肠癌壁外血管侵犯是固有肌层外的脉管细胞中有肿瘤细胞侵犯，该类患者5年生存率低于30%〔8〕。相关研究显示，直肠癌壁外血管侵犯阴性者治疗后长期生存率明显高于阳性患者〔9〕。磁共振成像是术前评估壁外血管侵犯的主要手段，但临床应用中发现，磁共振成像检出的壁外血管侵犯患者明显多于组织病理学〔10〕，提示仍需要探索补充诊断壁外血管侵犯的治疗来提高诊断的准确性。直肠腔内三维超声检查多用于直肠癌患者T分期和N分期评估，在早期直肠癌患者病情评估中有较高准确性〔11〕。但关于直肠腔内三维超声评估直肠癌患者术前壁外血管侵犯的研究仍较为少见。

FHIT蛋白属于三联组氨酸家族，在人体多个组织器官中均有表达〔12〕。相关研究显示，胃癌、结直肠癌组织中FHIT蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织〔13〕，提示FHIT蛋白过表达与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。Apollon蛋白是凋亡抑制蛋白家族成员，属于该家族中分子量最大的蛋白，其结构中的特殊序列BIR能够与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9、线粒体促凋亡蛋白结合后促进其降解，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9前体活化，降低凋亡信号启动效率，肿瘤细胞无限生长，转移风险明显增加〔14〕。本研究结果提示FHIT、Apollon蛋白表达异常升高能够促进直肠癌细胞的转移和侵袭，进而提高老年直肠癌患者壁外血管侵犯的发生风险。

FHIT 能够通过线粒体依赖凋亡蛋白酶和死亡受体途径抑制细胞凋亡，但具体的分子机制仍未完全明确，与Apollon蛋白表达存在一定相关性〔15〕，同时FHIT、Apollon蛋白表达与肿瘤患者的临床病理特征可能存在相关性〔16〕。本研究结果提示FHIT、Apollon蛋白表达与老年直肠癌患者的临床病理特征密切相关，可能用于患者的预后评估。ROC曲线分析对老年直肠癌患者壁外血管侵犯的诊断效能结果显示，直肠腔内三维超声及FHIT、Apollon 蛋白联合检测的诊断效能最高。研究者采用siRNA法下调乳腺癌细胞中Apollon 基因表达，结果显示，乳腺癌细胞对铂类的敏感性明显增强〔17〕，说明Apollon 表达与乳腺癌的治疗转归存在相关性。本研究证实了直肠腔内三维超声检查结果及FHIT、Apollon 蛋白表达与患者预后密切相关，可作为预测老年直肠癌患者预后的可靠指标用于临床治疗。