长链非编码RNA在缺血性脑卒中的研究进展

冯冬军，马雪飞，于文霞，谭 明，关利新，翟凤国

(牡丹江医学院药理教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

缺血性脑卒中是我国中老年人致残和致死的主要疾病。缺血性脑卒中具有发病率高、早期诊断缺乏、死亡及致残率高[1]等特点。我国每五位死亡患者中至少有一位是死于脑卒中，其中缺血性脑卒中又占脑卒中的绝大多数，缺血性脑卒中已经成为威胁我国公众健康的主要病因。目前治疗缺血性脑卒中的一线药物是静脉组织型纤溶酶原激活剂，主要用来溶栓治疗，但是由于治疗窗窄，适用范围有限。目前，缺血性脑卒中的分子机制仍待进一步明确。Dharap等[2]研究发现，局灶性脑缺血可诱发大鼠脑内一系列LncRNA表达谱的改变。近年来，陆续有研究发现MEG8 、lncRNA Rian、 Malat1、MIAT等LncRNA在脑缺血损伤的发生发展中起着重要的作用。LncRNA作为缺血性脑卒中研究的新机制和新靶点，正成为缺血性脑卒中研究的重要方向，因此，本文将对lncRNA在缺血性脑卒中方面的研究进展进行综述。

1 缺血性脑卒中

1.1 病因及主要机制缺血性脑卒中是由于脑动脉区供血受阻而导致的局部脑组织及其功能的损害。其中自由基的生成、钙超载、兴奋性氨基酸、一氧化氮、炎症反应以及细胞凋亡是缺血性脑卒中发生的主要病理生理机制。缺血性脑卒中发生过程中无氧代谢占优势，导致细胞内pH值降低，为防止氢离子的累积，钠离子与氢离子交换器会泵送出额外的氢离子，以致大量的钠离子流入，引起细胞的电生理紊乱。此外，局部缺血还会减少腺嘌呤核苷三磷酸的储备，从而导致腺嘌呤核苷三磷酸酶失活，使脑细胞内活性钙的释放减少，同时内质网还会抑制钙离子的再摄取，导致细胞内钙超载，造成脑细胞的生理功能紊乱[3]。脑组织缺血再灌注后，氧气和其他血液成分的运输也会加剧由局部缺血造成的伤害，并引起脑组织超微结构的破坏。此外，线粒体功能受损，细胞凋亡和自噬途径失调也参与了脑缺血损伤的病理生理过程。

2 lncRNA

2.1 lncRNA的定义及发现在人类基因组30多亿个碱基对基因序列中，约有98.5%的非编码序列，其中绝大多数非编码序列被转录成长度大于200个碱基的非编码RNA被称为lncRNA[4]，lncRNA是一类主要的真核转录本，它们构成了哺乳动物基因组的重要组成部分。lncRNA会被加帽，剪接和聚腺苷酸化，它们通常不充当蛋白质合成的模板，但某些lncRNA也可以被核糖体吸引，并翻译产生小肽[5]。lncRNA起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。早在1991年就证实了lncRNA Xist参与X染色体失活的调控[6]，但当时并未引起科研人员的重视，直到2007年人才们开始聚焦于lncRNA的研究。随着研究的深入，人们发现lncRNA在众多生命活动过程中发挥着至关重要的作用。

2.2 LncRNA的分类lncRNA有多种不同的分类方式，从基因的角度可以将lncRNA大致分为6类：(1)正义LncRNA，与编码基因的一个或多个外显子重叠；(2)反义转录产物，与相反链上的转录产物部分或完全互补；(3)内含子LncRNA，由基因的内含子产生；(4)双向转录产物，与蛋白质编码基因共享相同的启动子，但转录方向相反；(5)基因间LncRNAs(LincRNA)，由位于蛋白质编码基因之间的序列独立转录；(6)增强子RNA(eRNA)，由蛋白质编码基因的增强子区域产生[7]。

2.3 lncRNA的主要作用模式LncRNA 的作用模式主要分为四大类：(1)信号模式，LncRNA的第一种作用是调控下游基因转录。不同的刺激条件和信号通路下，LncRNA将会被特异性地转录，并作为信号传导分子参与特殊信号通路的传导。一些LncRNA分子被转录后，拥有调控下游基因转录的作用。从生物体的角度而言，利用RNA进行转录调控是具有明显优势的，由于不涉及蛋白质的翻译，因此具有更好的反应速度，对于机体的某些急性反应可以做出更好更迅速的反应；(2)诱饵模式，LncRNA的第二种作用是分子阻断剂。这一类LncRNA被转录后，它会直接和转移因子或转录调节子结合，从而阻断了相应分子的作用和信号通路。由于LncRNA的结合，这类转录因子的功能会被阻断，从而调控下游的基因转录；(3)引导模式，第三种作用模式是LncRNA会与通常是转录因子的蛋白结合，然后将蛋白复合物定位到特定的DNA序列上；(4)支架模式，LncRNA 还可以起到一个“中心平台”的作用，即多个相关的转录因子都可以结合在这个LncRNA分子上。在机体或细胞中，当多条信号通路同时被激活时，这些下游的效应分子可以结合到同一条LncRNA分子上，实现不同信号通路之间的信息交汇和整合，有利于机体或细胞迅速地对外界信号和刺激产生反馈和调节[8]。

2.4 lncRNA的功能lncRNA在生物体内能够广泛通过染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白修饰、细胞周期调控等方式参与胚胎发育、细胞增殖分化以及神经系统疾病、心血管疾病、肿瘤等的发生发展，在转录、转录后以及表观遗传水平上调控靶基因的表达[9]。lncRNA不仅承担着遗传信息中间载体的辅助性角色，更重要的是在发育和基因表达中发挥着复杂精确的调控功能。lncRNA发挥功能主要依靠其二级结构与蛋白质结合，引起染色质重构、影响转录因子的功能等。此外，lncRNA还可以在其线性水平与微小核糖核酸(microRNA，miRNA，miR)结合，间接影响mRNA表达，同时也可以直接与mRNA结合，影响mRNA翻译、剪切、降解过程[10]。lncRNA与中枢神经系统密切相关，其失调可导致神经病理学状态的发生，例如神经退行性疾病、神经免疫疾病、原发性脑肿瘤和精神疾病[11]。因其与中枢神经系统过程的密切相关性，使得lncRNA可能成为在缺血性脑卒中进展中发挥重要作用的调控靶点。目前对lncRNA在缺血性脑卒中方面的研究还在不断探索中。

3 lncRNA与缺血性脑卒中

3.1 lncRNA在缺血性脑卒中进程中的作用lncRNA在多个层面上以复杂的作用机制广泛参与细胞分化、增殖、凋亡、自噬以及免疫反应和血管生成等过程[12]。在中枢神经系统的发育、维持稳态以及神经细胞功能行使等过程中lncRNA发挥着重要的作用，同时缺血性脑卒中会使lncRNA表达谱发生明显改变，在缺血性脑卒中患者和动物模型中，数千个异常表达的lncRNA被发现[13]。lncRNA通过钙超载、氧化应激、炎性反应、神经血管损伤、神经元坏死、神经保护与修复、突触功能破坏等途径影响缺血性脑卒中的进展及转归，参与缺血级联的分子过程[14]。

3.2 与缺血性脑卒中相关lncRNA的分类缺血性脑卒中相关的lncRNA既有对缺血性脑卒中有保护作用的lncRNA，也存在对缺血性脑卒中有损害作用的lncRNA，可按照lncRNA在缺血性脑卒中中的保护和损害作用主要分为两类。

3.2.1 具有保护作用的lncRNA (1)MEG8：MEG8参与了缺血性脑卒进程，通过对MEG8，miR-130a-5p和血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGFA)的表达进行分析发现，在糖氧剥夺(Oxygen and glucose deprivation，OGD)处理的大鼠脑微血管内皮细胞 (Brain Microvessel Endothelial Cells，BMEC)中，MEG8被上调、miR-130a-5p被下调，而VEGFA的表达上调。进一步研究发现，miR-130a-5p是MEG8的靶标，而VEGFA是miR-130a-5p的靶标，MEG8的下调通过负性调节经糖氧剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)处理的大鼠BMEC中的miR-130a-5p的表达，从而抑制细胞活力、迁移、血管生成以及VEGFA的表达。总之，MEG8降低了大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的脑缺血神经学评分和miR-130a-5p表达，并增加了VEGFA表达，即MEG8通过miR-130a-5p / VEGFA信号传导通路调节缺血性脑卒中后的血管生成并减轻脑缺血损伤。(2)lncRNA 1810034E14Rik：生物信息学提示lncRNA 1810034E14Rik可能参与先天免疫反应和凋亡过程。通过lncRNA芯片分析筛选发现，与炎症反应相关的1810034E14Rik在OGD和内毒素诱导的小胶质细胞中均下调。通过MCAO小鼠模型，发现过表达1810034E14Rik可显著改善脑缺血急性期症状，减少梗死体积和脑水肿。梗死皮质中的促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1b(IL-1b)受到1810034E14Rik负性调控，而抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-4(IL-4)在1810034E14Rik过表达后显著升高。此外，过表达1810034E14Rik可降低梗死皮质小胶质细胞的激活。同时上调1810034E14Rik也可抑制体外OGD诱导的小胶质细胞的激活并减轻炎症。这说明1810034E14Rik对缺血性脑卒中有改善作用，而其抗炎作用主要是通过影响小胶质细胞激活来实现的。小胶质细胞在MCAO后的梗死皮层被激活并分泌白细胞介素-1(IL-1), TNF-α和白细胞介素-6(IL-6)。然而，过表达1810034E14Rik逆转了这些细胞因子的增加。OGD刺激下原代小胶质细胞的结果与动物实验一致，OGD后小胶质细胞磷酸化抑制性卡巴蛋白(p-IκB)水平降低、磷酸化p65(p-p65)水平升高，同时p65在细胞核内的转移也被诱导，而过表达1810034E14Rik可逆转缺血引起的上述变化，由此可见1810034E14Rik是中风治疗的潜在靶标[15]。(3)lncRNA Rian：lncRNA Rian在脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤中发挥着重要的作用。在利用小鼠成神经细胞瘤(N2a)细胞OGD模型模拟脑I/R损伤，通过台盼蓝染色、活性氧的产生和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性检测细胞凋亡，并通过小鼠的MCAO模型来评估lncRNA Rian在小鼠脑I/R损伤过程中如何发挥作用的实验中，用real-time PCR和western blotting检测lncRNA Rian、miR-144-3p、GATA结合蛋白3 (GATA3)、caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的表达。结果表明，在脑I/R损伤的体内外实验中，lncRNA Rian和GATA3均下调，miR-144-3p上调。过表达lncRNA Rian可抑制OGD诱导的细胞凋亡。此外，lncRNA Rian过表达能明显减小梗死面积，提高脑缺血小鼠的神经功能学评分。lncRNA Rian过表达可在体内外消除miR-144-3p介导的体内和体外的脑I/R损伤。此外，GATA3是miR-144-3p的靶点，GATA3可受miR-144-3p和lncRNA Rian的协同调控。总之，lncRNA Rian/miR-144-3p/GATA3轴在脑I/R损伤中是一个重要的信号通路[16]。lncRNA Rian可能成为缺血性脑卒中患者治疗的潜在靶点。

3.2.2 有损害作用的lncRNA (1)MALAT1：肺腺癌转录本1(MALAT1)编码基因位于人染色体11q13，此lncRNA存在于细胞核核小体核斑区，长约8.1kb。在人类各组织中MALAT1具有较高表达丰度。MALAT1在缺血性脑卒中进程中发挥着重要的作用。在MCAO模型中会引起同侧皮质中MALAT1和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的显着增加，敲减MALAT1可以减轻脑缺血后的炎症损伤，而过表达MALAT1则会加剧缺血性的脑炎症。HMGB1是miR-181c-5p的直接下游靶标，miR-181c-5p可以靶向HMGB1的3'-UTR，同时又可以充当MALAT1的竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)促进缺血后的炎症发生。敲减MALAT1可显着降低HMGB1水平，此过程可以通过转染miR-181c-5p抑制剂来消除。综上，MALAT1 / miR-181c-5p / HMGB1信号通路可能是中风抗炎作用的关键途径，它们可能为缺血性脑卒中的靶向治疗提供新的途径[17]。(2)MIAT：lncRNA心肌梗死相关转录本(MIAT)最初被证实与心肌梗死有关，后来发现MIAT还与神经元发育以及神经血管功能障碍相关[18]。MIAT可以作为海绵吸附miR-204-5p的内源性ceRNA。MIAT在MCAO模型大鼠的脑组织中过表达，而MIAT的抑制可减轻MCAO大鼠的脑组织损伤。抑制MIAT可以促进MCAO大鼠脑组织中的血管生成及miR-204-5p表达并抑制HMGB1表达，减少OGD处理的脑微血管内皮细胞(Cerebral microvascular endothelial cells ,CMEC)的损伤，诱导CMEC的血管生成，增加存活神经元的数量。综上，MIAT可通过竞争性结合miR-204-5p来促进HMGB1表达，从而引起脑缺血后CMEC的损伤[19]。故MIAT将可能成为缺血性脑卒中治疗的重要靶点。(3)Gm11974：lncRNA Gm11974主要位于细胞质中。在使用转录组测序技术分析识别了大量I/R损伤中的差异lncRNA后，发现了Gm11974在脑I/R损伤中高表达。采用N2a细胞OGD模型模拟脑I/R损伤，发现敲除Gm11974可减轻OGD诱导的细胞凋亡，显著降低细胞死亡率。Gm11974能够负向调控miR-766-3p的表达，正向调控孕酮受体 (Nuclear receptor subfamily3, group C, member2, NR3C2)的蛋白水平引起缺血脑细胞的凋亡，Gm11974/miR-766-3p/NR3C2轴在脑I/R损伤中起重要作用。敲除Gm11974可以降低NR3C2的蛋白表达水平，在对Gm11974/miR-766-3p/ NR3C2轴在脑I/R损伤中的作用的进一步验证中发现，过表达miR-766-3p可以阻断Gm11974的作用。以上揭示了Gm11974可以通过海绵吸吸附作用于miR-766-3p来抑制miR-766-3p拮抗NR3C2功能的作用，进一步促进脑I/R损伤的细胞凋亡[20]。故lncRNA Gm11974可能成为缺血性脑卒中治疗干预的潜在靶点。

4 讨论

lncRNA有着重要的生物学功能并与缺血性脑卒中的进展紧密相关，有潜力成为缺血性卒中的生物标志物和治疗靶点。当前lncRNA在缺血性脑卒中方面的研究热点主要是通过研究lncRNA与miRNA以及靶蛋白之间的关系来确定lncRNA及相关通路在缺血性脑卒中中所发挥的作用。但目前相关研究也存在一定的局限性，由于lncRNA与miRNA之间并不一定互为唯一靶标，类似地，miRNA与靶蛋白之间也并不一定互为唯一靶标，而目前相关研究大多仅限于单一通路的研究，因此是否存在其他靶标和信号通路的串扰也值得相关研究进一步的考察和完善。目前，lncRNA在缺血性脑卒中方面的研究还不够充分，有很多新的lncRNA仍然需要我们进一步去发掘。在lncRNA水平揭示缺血性卒中的分子机制将为缺血性脑卒中的诊疗提供科学的依据，并有助于相关药物早日应用以造福患者。