骨软骨组织工程的研究进展

曹家全，王景燕，高海明，王 波，吴佳奇

(西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000)

软骨损伤(cartilage damage)是创伤骨科十分常见的疾病。由于其再生能力差的生理特性，以及缺乏神经支配，当软骨表面受损后疼痛感不明显，使得患者未能得到及时的诊断和有效的治疗，导致损伤进行性加重，继而会出现关节变形甚至功能障碍等一系列并发症。但软骨组织工程技术的出现为修复软骨和软骨缺损带来新突破[1]。组织工程(tissue engineering)是近年来正在兴起的一门新的学科，属于生物高技术范畴。此概念最早是在1987年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上提出，1988年正式被命名定义。组织工程技术的研究应具备以下三个主要条件：(1)足够数量且具备多向分化潜能的种子细胞；(2)合适的生物支架载体；(3)调节种子细胞增殖并维持其表型等特征的生长因子。

1 种子细胞

种子细胞是组织工程学中的第一个核心要素，也是组织工程学发展的瓶颈[2]。种子细胞可以分为非干细胞和干细胞两大类[3]。前者主要包括：成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞。后者主要包括：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、脂肪干细胞(adipose stem cells，ADSCs)、神经干细胞和胚胎干细胞等。在上述种子细胞中，骨髓间充质干细胞的研究最为成熟，已经广泛地应用于基础研究[4]。骨髓间充质干细胞最早由Friedenstein等[5]在骨髓中发现。大量研究显示[6]，骨髓间充质干细胞被认为是多功能干细胞，可以诱导分化为神经细胞、肝脏细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，甚至心肌细胞。由于具有多向分化，自我更新，免疫调节和其他作用的潜力，骨髓间充质干细胞已成为基因治疗，组织工程，细胞替代治疗和再生医学的种子细胞重要来源[7]。由于骨髓间充质干细胞的提取、分离及纯化过程较为复杂，存在细胞被感染、老化、数量不足等缺点，因此来源受到一定的限制。脂肪干细胞存在于脂肪组织中,是具有多向分化潜能的成体干细胞[8]；在一定条件下，也有向骨、软骨、内皮细胞及脂肪细胞等多向分化潜能，且具有取材容易、来源广泛、供应量充足、供区创伤小、免疫调节能力强等一系列骨髓间充质干细胞没有的优势[9]。因此，脂肪干细胞也可以作为骨组织工程理想的种子细胞来源。但其成骨能力远远不如骨髓间充质干细胞，在骨组织工程中不作为种子细胞首选[10]。

通常情况下，软骨细胞被当做软骨组织修复的最佳种子细胞选择，但实际上，软骨细胞的来源和取材均有限，取材后容易造成供区功能障碍；此外，细胞分离过程较为复杂，可能造成不可逆地损伤，在体外进行培养增殖过程中容易丧失软骨细胞特有的表型[11-12]。

2 合适支架

选择合适的材料是软骨组织重建的关键。目前常用的软骨组织工程支架材料主要有天然高分子材料(比如藻酸盐、壳聚糖、胶原、明胶、纤维蛋白胶、天然脱细胞基质材料等)和人工合成材料(比如聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (polylactic acid-glycolic acid copolymer，PLGA)、聚己酸内酯(polycaprolactone，PCL)等)[13]。然而，作为修复软骨缺损的金标准，自体移植物具有更好的成骨性，有较好的骨诱导性和骨传导性[14]。尽管，同种异体移植物和异体移植物具有一定的成骨能力，但具有包括降解速度慢、材料稳定性差、免疫排斥等缺点[15]。当前，经过特殊处理的自体或同种异体骨具有较好的生物强度和机械强度(例如生物相容性和生物降解性)，能降低供体部位发病率或病原体传播风险，是一种天然、绿色和安全的材料[16-17]。因此，同种异体骨支架成为软骨组织工程较理想的选择，也成为当前研究员的研究热点。

理想的骨组织工程支架应紧密模仿天然的骨骼环境。支架材料的选择是组织工程技术最核心问题，它不仅作为细胞的载体，而且对细胞的黏附、增殖、分化和表型的维持具有十分重要作用[18]。用于骨组织工程的理想支架应满足以下要求[19-20]：(1) 具有良好的界面亲和力，有利于种子细胞黏附、生长及分化；(2)具有稳定且足够的三维空间结构，有利于组织生长、物质移植和血管形成；(3)具有一定的生物力学特性和良好的生物可降解性，在缺损部位能够提供一定的力学强度，维持重建组织的形态，且易于降解；(4)具有良好的生物相容性，不引发炎症反应以及较低的免疫原性，能够较好的和受体相结合，确保修复组织的连续性和稳定性；(5)应具有调节生物活性因子的释放；(6)支架应易于制备成各种想要的形状和尺寸。由于组织来源的支架和天然组织的结构和组成十分相似。因此，组织来源的支架在生物医学应用中具有广阔的前景。然而，自体组织衍生的支架也具有许多移植的缺点，因为收获自体移植物限于可用的供体部位并且需要二次手术，因此对身体也会造成额外的损害[21]。

3 生长因子

生长因子已经被证实在组织工程技术中有十分重要的作用，尤其是在软骨修复方面得到了大量的验证。生长因子是指具有调控细胞生长、发育的一类生物活性物质，它们通过自分泌或旁分泌方式调节各种细胞的增殖和分化[22]。目前，骨组织工程中常用的生长因子包括：转化生长因子 (transforming growth factor, TGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、富血小板血浆(platelet rich Plasma，PRP)、富血小板纤维蛋白(platelet rich fibrin，PRF)等，大量研究表明[23]生长因子不仅可以促进细胞的生长、增殖及分化，而且多种生长因子协同作用可以有效地诱导干细胞向软骨分化并维持软骨细胞表型。

转化生长因子(TGF)是一种多肽类生长因子，可根据其组织结构的不同分为TGF-α和TGF-β两种类型。它们能有效地促进细胞的生长、增殖及分化，是干细胞向软骨分化的关键因子。在软骨组织工程中TGF-β1和TGF-β3的应用较为广泛，但其中TGF-β1可显著增加软骨相关的基因表达。Worster等[24]对BMSCs体外培养时发现，在培养基中加入TGF-β1可以诱导BMSCs定向分化为软骨细胞，其II型胶原(COLⅡ)的表达与 TGF-β1的剂量呈正相关，5～10 ng/mL的TGF-β1，可有效地促进BMSCs向软骨方向的分化。而TGF-β3主要对BMSCs向软骨分化起调节作用，其参与了软骨分化中的细胞聚集、增殖和分化阶段；郑东等[25]通过特定方式从大鼠胚胎组织中获取TGF-β3的基因片段并转染至大鼠来源的ADSCs中相应的DNA片段(重组质粒)中，将转染后的ADSCs在特定的环境下进行培养,分别于第7、14、21天进行免疫组化染色，与对照组相比，实验组的COLⅡ、Aggrecan、TIMP的表达明显增加，表明了TGF-β3有促进ADSCs向软骨细胞分化和软骨基质的能力。艾力麦尔旦·艾尼瓦尔等人[26]在一系列体外实验发现，浓度在10～100 μg/L范围内的TGF-β3可有效促进兔成骨细胞的增殖和成骨能力,其中TGF-β3的质量浓度为10 μg/L时，Ⅰ型胶原蛋白、Runx-2、骨钙素基因的表达最明显。

成纤维细胞生长因子(FGF)由垂体和下丘脑分泌的多肽。包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)两种，能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及骨软骨缺损修复和再生中发挥重要作用。目前，FGF在现代临床医学、外科手术及医学美容中发挥着不可估量的巨大作用[27]。此外，bFGF也常用于软骨组织工程，其中FGF2和FGF18与关节软骨的稳态维持密切相关[28]。户小伟等[29]研究发现，bFGF能促进BMSCs向成骨细胞分化，并呈时间依赖性；其最佳作用浓度为50 ng/mL。bFCF可刺激成纤维母细胞的生成，是目前发现的最有效的血管生长因子之一，能促进骨、软骨、神经和软组织修复[30]。可激发促进BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的潜能，具有体内、外诱导成骨和成血管作用，因此可以促进骨修复。周琦琪等[31]研究发现，bFGF能明显增加BMSCs的增殖速度。虽然，多个实验研究表明[32]，bFCF有明显促进BMSCs向软骨分化的潜能，但过程十分复杂，仍然是临床上一个难点，具体机制及临床效果仍需进一步研究，以阐明体内和体外软骨再生的最佳策略。

骨形态发生蛋白(BMPs)是在1963年由美国的Marshall R.Urist教授发现的一种分泌性的多功能蛋白，对于骨和软骨组织的生长具有重要作用。目前为止，已被发现的骨形态发生蛋白至少有20种，其中骨形态发生蛋2,4,6,7和9研究最为广泛[33]。在一定条件能够诱导形成软骨、肌腱、韧带等组织结构，甚至能参与相应神经及内脏组织的修复工程[34]。在骨科领域中，骨形态发生蛋白的临床应用主要在治疗新鲜骨折、骨缺损、骨不连、脊柱融合及股骨头缺血性坏死等5个方面[35]。阮世强等[36]通过BMP2基因过表达的方式刺激脂肪干细胞，同时结合Mosaicplasty技术可显著促进软骨缺损修复，即转染BMP2对骨软骨的缺损有更佳的临床修复效果。Kemiss等[37]运用BMP6成功地诱导小鼠脂肪干细胞分化成骨细胞和软骨细胞，表明BMP6有促进脂肪干细胞向成骨和成软骨分化的潜能。其中，BMP9作为骨形态发生蛋白家族的关键分子,具有极强的促进干细胞分化与骨组织再生的能力[38]。BMP9主要通过BMP9-SMAD信号通路和BMP9-MAPK信号通路来实现对干细胞分化的调控作用[39]。BMPs具有较高的安全性和有效性，在骨与软骨工程中具有较高的临床价值，也是当今骨科研究的热点之一，其过程较为复杂，有待进一步更加深入研究。

近年来，富血小板血浆(PRP)和富血小板纤维蛋白(PRF)也广泛应用在软骨组织工程方面，其含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子-β(TGF-β)，类胰岛素生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)等，可有效的促进骨折愈合、软骨细胞增殖及软骨细胞外基质合成[40-41]。

4 结论

综上所述，组织工程应具备三个基本要素：较强增殖能力和多向分化潜能的种子细胞，生物相容性良好的细胞支架及促进细胞增殖分化的细胞因子，其中种子细胞和生物支架是最为重要的因素，是构建组织工程生物替代物获得成功的前提条件。然而在临床工作中，不易找到合适的替代物，导致骨软骨组织工程技术的发展缓慢，且患者的治疗效果很难达到满意的效果。随着材料科学和细胞生物学的发展和创新，骨组织工程技术为软骨、软骨下骨损伤的再生和修复带来了新的希望。本文总结近几年来国内外骨组织工程技术的研究进展，为软骨及软骨下骨的重建和修复的基础研究及临床应用提供可靠的依据。