母体外周血循环miRNA和子痫前期的研究进展

张文琦 姚春凤 胡小娜 宋志慧 贾燚鑫

1华北理工大学临床医学院 河北唐山 063000；2唐山工人医院妇产科；3唐山市妇幼保健院

子痫前期是指既往无高血压病史，妊娠20周后确诊的多系统疾病，占妊娠相关并发症的4.6%[1]，是导致胎儿生长受限、死胎及孕产妇妊娠相关死亡的最常见原因之一[2]。目前研究发现，针对子痫前期高危人群予以预防措施，如口服低剂量阿司匹林可以降低子痫前期早产的发生率[3]。但通过超声检查结合生物物理参数不能准确预测子痫前期的发生，因此寻找合适的生物标志物辅助临床医师进行综合判断十分必要。随着非编码RNA的研究进展，miRNA以其特异性、稳定性等特点受到广泛关注。研究表明母体外周血循环中的miRNA可能与子痫前期的发生发展密切相关，有望成为预测子痫前期的生物标志物，对子痫前期的诊治具有重要意义。本文就子痫前期病理生理机制、miRNA的结构功能及母体外周血循环miRNA与子痫前期的相关性研究进行综述。

1 子痫前期病理生理机制

1.1胎盘缺血缺氧 在子痫前期的研究过程中胎盘一直是人们关注的重点。有研究发现子痫前期患者的胎盘梗死较正常妊娠患者增加，提示子痫前期患者胎盘存在缺血缺氧[4]。子痫前期患者胎盘损伤反映了母体灌注不良，病变主要有绒毛组织梗死、无绒毛胎盘血池、炎症及纤维蛋白沉积等[5]。在子痫前期胎盘的研究中，最开始提出了两阶段模型，即胎盘阶段和临床上明显的母体疾病阶段，均考虑是由于螺旋动脉重塑异常引起并进一步加重胎盘缺血缺氧。有研究进一步发现滋养细胞的侵袭及迁移是螺旋动脉重塑的基础[6]，Lyall等[7]发现在子痫前期细胞滋养层侵袭不足，致螺旋动脉重塑不良，重塑本身对胎盘的血流量及氧合作用的影响并不明显，但是通过数学建模发现重塑可以使血流的速度和脉动性降低一个数量级，可以减轻对胎盘绒毛及微绒毛的损伤。然而在子痫前期患者中发现其螺旋动脉重塑不良，母体血流速不能明显降低，以喷射状流入绒毛间隙，使绒毛损坏，形成点状血栓排列的囊性病变，使得胎盘的血供氧供减少，进一步导致子宫动脉的阻力增加，加重胎盘的缺血缺氧[8]。这些研究与两阶段子痫前期模型并不相悖，而是进一步的探索了螺旋动脉重塑不良对子痫前期的影响。但是临床中发现大多数晚发型子痫前期足月分娩的新生儿不受生长限制，与胎盘的不良不符，因此考虑最初的两阶段模型主要是适用于早发型子痫前期。Redman等继续研究发现子痫前期的第二胎盘病因[9]，即足月胎盘的灌注不良，并无胎盘不良而发生胎盘生长超过子宫容量，导致末端绒毛受压阻碍灌注，从而导致合体滋养细胞缺氧和应激。因此对子痫前期的两阶段模型进行了更新，该模型提出第一阶段为胎盘功能失调，第二阶段为母体临床综合征。第一阶段可能由三方面原因所致：①滋养细胞侵袭异常导致子宫螺旋动脉重塑障碍；②妊娠晚期胎盘超过子宫容量导致末端绒毛受压，绒毛灌注失调，进一步加重胎盘缺血缺氧；③过度的滋养细胞衰老[10-11]。更新后的子痫前期两阶段模型更好的解释了临床中子痫前期患者，尤其是晚发型子痫前期患者的生理病理过程。

1.2氧化应激 氧化应激是由于氧化及抗氧化之间失平衡所致，可以导致高血压，也可以促进高血压的病理发展。氧化应激与妊娠及生殖系统疾病相关，由于胎盘线粒体的活性增加以及活性氧(ROS)的产生，胎盘自妊娠早期即处于氧化应激状态[12-13]。在正常的胎盘形成过程中ROS的作用类似于第二信使，参与细胞增殖、迁移及血管形成等过程[14]，当ROS超过机体的抗氧化能力时，氧化应激随之发生，导致子痫前期的发展[15]。有研究表明氧化应激发生在子痫前期中[16]，但是氧化应激是否为子痫前期子宫灌注减少的因素仍未明确。因大鼠子宫灌注压降低导致心血管及肾脏异常与人类子痫前期的心血管与肾脏异常相似，Sedeek等通过在妊娠第14d大鼠的腹主动脉及卵巢动脉上放置银夹使其子宫灌注压降低，发现造模大鼠的平均动脉压升高，血清及胎盘中氧化应激标志物如胎盘异前列烷、丙二醛及超氧化物均升高，活性氧活性降低[17]，说明胎盘缺血导致全身氧化应激增加。在另一项动物试验研究中发现子痫前期大鼠延髓腹外侧区(RVLM)的ROS水平升高，向RVLM注射超氧化物歧化酶模拟物(Tempol)减少氧化应激可以使子痫前期大鼠的心血管功能得到改善[18]。除发现氧化应激在子痫前期中的表达异常，在体外细胞学试验中也证实中、高浓度的ROS可诱导滋养细胞凋亡，影响滋养细胞的侵袭及迁移，激活或破坏内皮细胞进而导致子痫前期的发生[19-20]。

1.3免疫失调 正常妊娠与母体的免疫耐受密切相关，可以让母体适应胎儿及胎盘的生长，限制对其的不良免疫反应。

1.3.1补体的过度激活和抑制失衡 补体的过度激活和抑制失衡均会导致不良妊娠结局的发生，有研究发现子痫前期患者的全身补体激活产物例如C4d、C3a、可溶性C5b9显著升高，这表明子痫前期患者的补体系统被激活[21-22]。通过免疫荧光染色技术发现子痫前期患者的合体滋养细胞的包膜上膜攻击复合体(MAC)及C4d的表达升高，提示补体系统的激活可能与胎盘的损伤及缺血密切相关[23]。在动物模型验证中，Pierik等发现对子宫-胎盘灌注子痫前期模型大鼠予可溶性补体受体1、C3a受体拮抗剂或C5a受体拮抗剂，其模型大鼠的血压较前下降[24]。这些研究均说明胎盘的补体激活、免疫失调与子痫前期胎盘损伤有着直接的联系。

1.3.2T细胞的免疫耐受受损 细胞的免疫耐受受损也是子痫前期免疫失调的一个表现。在子痫前期患者中发现其局部及全身的Th1及Th17细胞因子失衡，抑制性Treg及Th2细胞因子下降。应用加压素制作的子痫前期小鼠模型同样发现Th1及Th17增加，Treg及Th2细胞因子减少[25]，从而揭示了子痫前期中Th1、Th17、Treg、Th2失衡与子痫前期的关系。除此之外，T细胞中“复合体”的激活也与子痫前期的补体系统激活密不可分。CD4 T细胞在T细胞溶酶体的作用下产生C3、C5，进一步与同源抗原及T细胞抗原受体(TCR)结合，C3转变为C3b，与T细胞表面补体受体结合进一步激活T细胞，C5转变为C5a，影响细胞内转导及Th1 T细胞的分化[26]。

2 miRNA的结构及功能

miRNA是一类单链RNA分子，大约由22～25个核苷酸组成，目前发现的2000余种miRNA在人体中发挥着重要的调节作用[27]，据估计参与细胞增殖、分化、凋亡及发育的蛋白质基因编码翻译约60%以上均有miRNA的参与[26]。目前发现的miRNA主要由内含子及少量蛋白质编码基因的外显子转录，其余为基因间的转录[28-29]。成熟的单链miRNA存在由2～8个核苷酸组成的高度保守序列，该段序列可以与一至数百个靶基因的mRNA 3’未翻译区的碱基互补配对并结合，其主要功能为通过抑制翻译、降解逆转录物及沉默基因表达，从而抑制mRNA[30]。miRNA在血浆、血清及尿液中稳定存在，为成为生物标志物提供了机会[31]。

经滋养细胞、原代滋养细胞以及内皮细胞系等细胞实验验证，发现miRNA的过表达或沉默影响其细胞的侵袭迁移能力，可能进而影响胎盘的发育及功能。目前研究于胎盘中发现约600种miRNA,例如定位在19号染色体的miRNA簇(C19MC)及miR-371-3簇，定位于14号染色体的miRNA簇(C149MC)及定位于13号染色体的miR-17-92簇。除此之外还有miR-34家族、miR-181c、miR-99a等。其中位于19号染色体的miRNA簇是人类最大的miRNA簇之一，包含约54个miRNA，C19MC几乎仅在胎盘中表达，与人类的胚胎发育相关[32-33]。妊娠早期即可检测到C19MC miRNAs的表达，并随孕周的延长在胎盘滋养细胞中显著增加[34]。C19MC miRNAs是控制滋养层细胞分化，血管生成及侵袭、迁移的重要因素，其表达异常可能导致滋养细胞功能异常、子宫螺旋动脉重塑不良，进一步导致子痫前期的发展[28，35]。

3 循环miRNA与子痫前期

循环miRNA为各种疾病的生物标志物的探索带来了新的思路，循环miRNA以其无创性成为多种疾病的生物标志物研究的热点[36-38]。子痫前期疾病中关于miRNA的研究从胎盘组织开始，后经细胞学实验及动物模型实验证实与子痫前期疾病的致病机制密切相关。随后研究发现部分胎盘来源的miRNA在母体外周血循环中随孕期动态变化。胎盘来源的miRNA可以从滋养细胞中释放入血，在稳定蛋白的保护下或外泌体的包裹中在血液中稳定存在，免受降解[27,39]。我们发现妊娠母体循环中外泌体水平升高，目前检测到的早发型和晚发型子痫前期母体循环中总外泌体及胎盘衍生的外泌体存在显著差异，推测外泌体中包裹着的miRNA也存在差异，使得循环中外泌体中的miRNA有望成为监测滋养细胞及胎盘功能的生物标志物。在子痫前期的研究过程中，母体循环miRNA的研究被广泛关注，为子痫前期的无创性预测提供了可能[40]。

3.1循环miR-210与子痫前期 miR-210参与线粒体功能调节及缺氧反应，对于miR-210的研究始于肿瘤学，在肿瘤疾病中发现miR-210可以抑制细胞的增殖及促进细胞凋亡，进而抑制肿瘤的生长。在子痫前期疾病的研究过程中发现，与正常妊娠患者相比，miR-210在子痫前期患者胎盘组织中的表达升高，可以调节滋养细胞增殖、分化及缺氧，影响螺旋动脉重塑[41]。随着循环miRNA的迅速发展，研究发现与正常妊娠患者血浆相比，子痫前期患者的血浆中miR-210的表达显著上调：在轻度子痫前期患者血浆中升高约3.27倍，在重度子痫前期患者血浆中升高约9.49倍[42]。有研究对子痫前期不同严重程度的患者进行血清miR-210的检测，发现其表达水平与疾病严重程度呈正相关[43]。Li等通过绘制受试者工作曲线(ROC)来评估子痫前期上调的miRNA的预测值，发现在中期妊娠患者miR-210的预测值为0.93[44]，这表明miR-210有望成为子痫前期的稳定生物预测指标。miR-210作为缺氧激活因子，在机体发生缺血缺氧时，组织中的miR-210表达上调，促进新血管的生成，同时也会导致滋养细胞功能异常，从而导致胎盘缺血、缺氧进一步加重，促进子痫前期疾病的进展。近期有研究发现miR-210可以靶向参与滋养细胞功能调节的968个预测靶向基因，同时其下游靶基因如Wnt家族成员2(Wnt2)、双特异性磷酸酶9(DUSP9)等多个基因广泛参与新陈代谢及生长发育，因此miR-210的失调，可能不仅参与胎盘功能失调[45]，而且对子痫前期母体临床综合征的形成存在重要的影响[46]。

3.2循环miR-155与子痫前期 miR-155为内皮依赖性血管舒张的重要调节剂，miR-155被发现在子痫前期患者胎盘中表达上调，与富含半胱氨酸的蛋白61(CYR61)密切相关，miR-155可以与CYR61mRNA 的3’-UTR相结合，抑制转录及翻译[47]。Shen等发现与正常妊娠患者相比，子痫前期患者血清miR-155表达升高，miR-155可以降低原代脐静脉内皮细胞的内皮一氧化氮合酶(eNOS)和一氧化氮(NO)的表达[48]，通过这项研究我们发现miR-155与子痫前期内皮功能障碍密切相关，可能通过抑制eNOS影响内皮细胞的功能进而导致子痫前期的发生。Yang等[49]发现子痫前期患者血浆中miR-155表达水平较正常妊娠患者升高，同时发现miR-155的血浆表达与白介素17(IL-17)、母体蛋白尿及尿足细胞数量呈正相关，miR-155的过表达可以导致CD4+T细胞产生更多的IL-17，导致足细胞中肾病蛋白(nephrin)的降低和足细胞凋亡，导致子痫前期患者蛋白尿的形成及进展。Wang等[50]对子痫前期患者及健康孕妇孕早期的血清进行miR-155检测，再次证实miR-155在子痫前期患者血清中表达显著升高，运用ROC曲线分析发现基于miR-155水平的ROC曲线下面积为0.93，95%可信区间为0.893～0.967，说明孕早期的miR-155的血清水平可能对预测子痫前期的发生有一定的价值。关于miR-155与子痫前期发病机制的研究中，Witvrouwen等[51]提出了一个新的观点，即外周血循环miR-155下调细胞因子信号转导抑制物1(SOCS1)，导致JAK2/STAT3信号通路被激活，进一步导致血管内皮生长因子(VEGF)的表达增加。VEGF在孕早期的浓度下降，可以使滋养层细胞侵入，完成螺旋动脉重塑，但在子痫前期患者中，VEGF的表达升高，导致螺旋动脉重塑异常，进而发生胎盘缺血缺氧，缺血缺氧的胎盘可以在循环中分泌抗血管生成因子，导致血管壁受损，形成恶性循环。

3.3循环miR-144与子痫前期 miR-144为缺血、缺氧的调节因子，在子痫前期患者的胎盘组织低表达，Xiao等[52]证实了这一结果，并且通过细胞学实验发现miR-144通过靶向磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN),诱导PTEN表达增加，使滋养细胞的侵袭及迁移能力受损，增加细胞凋亡，可能影响螺旋动脉重塑。对于母体外周血循环miR-144，Li等[53]通过对子痫前期患者的血浆进行miRNA分析，并对不同子痫前期患者母体血浆进行验证，发现miR-144在子痫前期患者中低表达，同时发现失调的miRNA在轻度子痫前期患者中比重度子痫前期患者中更明显，这与他们预期的结果不同，考虑miRNA与子痫前期患者早期病理变化相关。这项实验显示miR-144在子痫前期患者血浆中差异表达，并且可能与子痫前期疾病程度密切相关。随后Jairajpuri等[54]通过对轻度子痫前期及重度子痫前期患者的血浆进行分析，发现miR-144在重度子痫前期患者的表达降低，并推测miR-144可能通过对转化生长因子-β(TGF-β)的调控来进一步影响胎盘的发育，但该实验并未针对这一观点进一步证实。Hu等[55]发现miR-144-3p负向调控环氧化酶-2(Cox-2)，Cox-2为前列腺素合成的限速酶，可以调控前列腺素的合成水平，子痫前期患者胎盘组织中Cox-2表达升高，大量炎性物质刺激并粘附于内皮细胞表面表达的白细胞上，大量的前列腺素可以刺激促炎细胞因子的产生，并且使血管的通透性增加，促进单核巨噬细胞迁移及单核细胞粘附，诱导巨噬细胞趋化，最终导致子痫前期的内皮细胞损伤及全身炎症反应。在miR-144对子痫前期致病机制研究过程中，环状RNA的作用也受到关注，最新研究表明CircZDHHC20及Circ_0085296分别可以通过miR-144/GRHL2轴及miR-144/E-cadherin轴影响滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭，进而可能影响螺旋动脉重塑[56-57]。

3.4循环miR-1233与子痫前期 多项研究发现miR-1233与肿瘤疾病密切相关，并可能成为癌症诊治的生物标志物。在子痫前期疾病中，miR-1233也逐渐受到关注，首先是Ura等[58]通过妊娠12～14周的患者血清进行微陈列分析，发现与正常妊娠相比妊娠晚期发生重度子痫前期的患者血清中存在19个差异表达的miRNA，其中12个上调，7个下调，继续通过qRT-PCR技术对miR-1233进行验证，发现miR-1233作为上调的miRNA在两组病例中的差异最大，表明它是重度子痫前期患者血清中表达率最高的miRNA；这项研究提示了早期失调的miRNA与子痫前期的发病机制存在潜在相关。Munaut等[59]选取妊娠24～36周的孕妇采集母体血清，根据患者分娩时的情况，进行回顾性研究，结果发现子痫前期患者中miR-1233-3p显著上调，并对其进行ROC曲线分析，发现miR-1233-3p的曲线下面积为0.673，说明miR-1223有望成为预测子痫前期的生物标志物之一。目前尚无关于母体外周血miR-1223与子痫前期发病机制的研究，仍需进一步探索。

子痫前期母体循环中miRNA的研究还有很多，越来越多的研究者对子痫前期患者胎盘及循环中的miRNA的表达情况进行比较，从而为子痫前期的疾病预测提供更有利的支持。但是针对循环miRNA在子痫前期疾病发生发展中的机制尚未进行更加充分的研究，需要进一步深入探索。除此之外，在子痫前期患者母体循环中发现的差异性表达的miRNA在不同研究结果中的重合度不高，这可能与入组的病例数量不够充分有关，同时不同的RNA提取方法也会对结果产生一定的影响，因此发现更为稳定方便且统一的RMA提取方法也是我们需要进一步努力的方向之一。

在子痫前期母体循环miRNA作为生物标志物的研究过程中，母体循环miRNA的采集时机与疾病之间的关系也应予以考虑。根据目前研究表明，循环miRNA在不同孕周的表达可能有所不同，在疾病的不同病情程度中的表达也可能动态变化，目前尚无动态监测子痫前期患者整个孕期循环miRNA变化的相关研究。循环miRNA作为潜在生物标志物仍需要进行验证，并将其与疾病的机制相结合，以更好的解释子痫前期的发展过程，为临床的相关工作提供更有利的理论支持。

4 小结与展望

目前，子痫前期的发病机制仍未完全阐明，因疾病的动态性及异质性需要对其进行更为广泛及深入的探索。miRNA广泛参与子痫前期的病理生理过程。循环中miRNA因其稳定的特性可以得到更好的检测，为成为子痫前期的生物标志物提供了可能。然而，到目前为止，我们的研究只是发现了循环miRNA在子痫前期患者中的表达差异，其差异表达所涉及的机制并未深入的研究，并且因个体差异及病例数量的限制，不同研究的循环miRNA重叠较少，因此需要我们进一步探索，从而找到合适的子痫前期生物标志物用以预测子痫前期的发生发展过程，为子痫前期疾病的早期预测提供更有利的工具。