肝缺血再灌注损伤相关通路的研究进展

欧可，彭秀达，费书珂

（南华大学衡阳医学院附属第二医院 肝胆胰脾外科，湖南 衡阳 421001）

肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injure，HIRI）广泛存在于失血性休克复苏、创伤、肝移植、肝切除等临床过程中[1-2]。目前HIRI的发病机制主要为两个阶段，最初的细胞损伤由缺血缺氧直接导致，主要改变是代谢性酸中毒和细胞内钙水平的升高以及相应的损伤；随后当血液再灌注回流时，活性氧的异常蓄积和库普弗细胞、淋巴细胞、中性粒细胞的激活会导致后续一系列的细胞反应[3]。其中炎症反应的传播和进一步组织损伤的机制涉及细胞因子/趋化因子、多种细胞类型和各种信号通路的复杂相互作用[4-5]。随着研究的逐步深入，HIRI中越来越多的信号通路和机制被证实或发现，有的通路通过促进免疫细胞激活加重肝细胞损伤；有的通路通过介导适应性应激或抑制免疫细胞激活对肝细胞产生保护；有的通路则根据调控通路中不同途径起到双向调节的作用。目前HIRI相关分子机制的研究仍处于由临床现象到动物实验的转化，因此为了更好地实现基础实验到临床的转化，我们需要更进一步的深入了解在HIRI中信号通路各部分的调控过程、相关效果以及各个通路的相互作用。本文根据信号通路在HIRI被激活后对机体的作用，从损伤性作用、保护性作用、双向调节、相互串扰四个方面对近年来HIRI相关通路的最新研究进行介绍，为后续研究提供参考。

1 HIRI的损伤性相关信号通路

1.1 HIPPO/YAP

MST1/2-LAST1-YAP（mammalian Ste20-like kinase1/2-large tumor suppressor-yes-Associated Protein，MST1/2-LAST1-YAP）通路即我们俗称的河马通路，最初被发现是作为调节器官大小的因子。河马信号通路的功能主要通过调节YAP的磷酸化和失活，既往研究表明YAP在人恶性肿瘤中被广泛激活。近年来有研究表明内源性YAP在小鼠HIRI中的表达有变化，HIRI促进河马核心激酶信号级联（MST1/2-LAST1）并磷酸化YAP，使YAP的核转位减少，增加了Toll样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）驱动的炎症[6]。同时当YAP的核转位减少后，抗氧化基因的表达减少，增加了活性氧的蓄积导致肝细胞的凋亡和坏死，加重HIRI[7]。在验证HIRI动物体内实验的同步低氧-复氧应激的原代肝细胞实验中，促进YAP的表达能减少肝细胞的死亡，并保存了线粒体的完整性，同时抑制YAP的表达加剧肝细胞的死亡[7]。Li等[8]的研究表明，在小鼠HIRI模型中骨髓间充质干细胞通过使MST1/2和LATS1的磷酸化减少，降低NLRP3/Caspase-1活性和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的释放，增加M2巨噬细胞表型，使河马信号通路的表达受到抑制，从而减轻HIRI。同时有实验发现加入YAP激动剂溶血磷脂酸能够抑制小鼠HIRI模型中巨噬细胞的募集和和活化，缓解小鼠HIRI[9]。

1.2 HMGB1/TLR4

高迁移率族蛋白B1（high mobility group box protein 1，HMGB1）是一种真核细胞中重要的损伤相关的分子，具有细胞因子样活性，并通过与TLR4受体复合体中的髓样分化蛋白-2结合介导无菌性炎症[10-11]。在小鼠HIRI期间，HMGB1可来自损伤坏死的肝细胞中被动释放，也可被部分激活的细胞主动分泌。HMGB1与TLR4结合会激活细胞内信号级联反应，该过程包括激活后的TLR4受体募集并活化髓样分化因子88，活化后的髓样分化因子88同时募集着IL-1 受体相关激酶，导致丝裂原活化蛋白激酶通路的激活，以及NF-κB（nuclear factor kappa-B）的核转位和下游基因的转录，使免疫细胞的募集与激活增加以及炎症因子和趋化因子分泌增多，进而促进炎症、细胞死亡和器官损伤，加重HIRI[10]。有研究表明，在小鼠HIRI模型中重组人血栓调节蛋白（RTM）能通过抑制HMGB-1/TLR4 通路，使肝细胞中HMGB1和TLR4的释放减少，对HIRI起保护作用[12]。同时解天军通过实验证明，甘草次酸能够通过抑制小鼠HIRI中HMGB-1/TLR4 通路的激活，降低HMGB1的表达，减少炎症因子的释放及中性粒细胞的浸润，实现减轻HIRI[13]。

1.3 mTOR/S6K/HIF-1α

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）作为非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶在新陈代谢、细胞生长和增殖等过程中起着重要的调节作用[14]，mTOR的作用靶点是两个不同的多蛋白复合体，即mTORC1（mTOR complex1）和mTORC2（mTOR complex2）[15]。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）主要是在细胞凋亡中发挥作用。在小鼠HIRI过程中，mTOR/S6K/HIF-1α通路会被激活，mTOR的靶蛋白mTORC1被激活后会磷酸化激活S6K（ribosome protein subunit 6 kinase），虽然HIF-1α的稳定性不受mTORC1的调节，但是HIF-1α的蛋白翻译过程受到S6K的调控[16]，因此mTOR/S6K信号正向调节HIF-1α的活性，HIF-1α的活化通过促进巨噬细胞的浸润和活化促进炎症的进展[17]，进而加重HIRI。Zhu等[18]的研究表明在小鼠HIRI中转录激活因子3 缺乏通过上调mTOR及下游靶基因S6K，进而激活固有的TLR4，增加HIF-1α，同时降低脯氨酸羟化酶1的活性，导致诱导叉头盒蛋白3表达阳性（Foxp3+）的调节性T细胞的抑制，促进维A酸相关孤儿受体γt表达阳性（RORγt+）的辅助性T细胞的分化，从而加重IR诱导的肝脏炎症。

1.4 ALOX12-12HETE-GPR31

花生四烯酸-1 2-脂加氧酶（arachidonate 12-lipoxygenase，ALOX12）具有调节血小板聚集、细胞迁移、癌细胞增殖的功能[19-20]，既往研究主要集中于肿瘤、动脉粥样硬化等方面，最近的研究发现ALOX12在小鼠HIRI缺血期中高表达，ALOX12在肝细胞中的上调促进了12 羟基二十碳四烯酸（12-hydroxyeicosatetraenoic acid，12-HETE）的积聚，12-HETE可直接与G蛋白偶联受体31（G-proteincoupled receptor 31，GPR31）结合，激活下游的NFκB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联反应，以及随后炎症反应的发生，包括白细胞募集和激活等过程，从而引发肝脏炎症，加剧肝脏损伤，应用ALOX12 抑制剂能显著抑制HIRI中肝功能障碍、细胞死亡和炎症反应[21]。

2 HIRI的保护性相关信号通路

2.1 HO-1-SIRT1-p53

血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是一种限速酶，在哺乳动物和人类中广泛存在，其主要功能是催化血红素转化为铁、一氧化碳和胆绿素，具有抗氧化和抗炎等功能[22]。Sirtuin 1（SIRT1）是一种去乙酰化酶，既往研究主要表明其在细胞衰老、炎症和应激抵抗等方面起关键作用，目前已有研究表明SIRT1在小鼠HIRI中具有抗炎作用[23]。肿瘤蛋白53（the p53 tumor suppressor protein，p53）是一种转录因子，在细胞凋亡、细胞周期、DNA修复和肿瘤的发生中能够调节靶基因的表达。有实验发现在小鼠HIRI模型中一条新的信号轴即HO-1-SIRT1-p53信号通路，在该通路中HO-1 正向调节SIRT1，而SIRT1 诱导的抑癌基因Arf抑制MDM2（murine double minute 2，MDM2）E3连接酶活性使p53泛素相关的降解减少，最终该通路中上调的p53 使巨噬细胞的激活减少，进而减少巨噬细胞活化后释放的促炎因子及趋化因子使HIRI减轻[24]。同时有研究表明，远端缺血预处理能够通过影响抗氧化应激及炎症反应减轻小鼠急性肝损伤，其机制可能与通过调控HO-1的表达有关[25]。因此我们下一步研究可以探讨远端缺血预处理是否对HIRI中HO-1-SIRT1-p53信号通路产生影响。

2.2 Wnt/β-catenin

Wnt介导的通路包括典型的Wnt通路和非典型的Wnt通路[26]，已有研究证明该通路在细胞的增殖、分化、发育和死亡中起着重要的调节作用。目前研究最广泛的是典型Wnt通路，即是Wnt/β-catenin通路，主要通过调节转录共激活因子β-catenin的数量发挥作用。在小鼠HIRI过程中Wnt/β-catenin通路被激活，β-catenin不会被降解复合体（Axin、Apc和Gsk3β）磷酸化，然后移位到细胞核内，在核内β-catenin与T细胞因子4 结合，激活靶基因的表达，起到促进细胞增殖的作用。β-catenin一方面可以抑制PTEN10（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10）的活性，促进PI3K/AKT（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/Akt）信号转导，减少细胞凋亡和炎症反应；另一方面，β-catenin还可以直接抑制NF-κB的激活，从而抑制一系列炎症反应。有实验证明，AgM通过激活Wnt/β-catenin途径减轻小鼠HIRI时的炎症反应和细胞凋亡，从而减少HIRI；与此同时，当Wnt/β-catenin通路被相关通路抑制剂抑制时，AgM的保护作用减弱[27]。方祀福研究证明，饱和氢气生理盐水能够通过促进Wnt/β-catenin通路，减少β-catenin降解，调控大鼠HIRI中细胞凋亡及炎症反应减轻HIRI[28]。

2.3 Hedgehog/SMO/Gli1

Hedgehog/SMO/Gli1通路已被证实可调节细胞的生长、分化和免疫功能[29-30]。Hedgehog/SMO/Gli1通路的激活需要两种必须蛋白质，包括G蛋白偶联受体smoothened（SMO）和12 跨膜区段蛋白Patch1（Ptch1）。在没有Hedgehog配体的情况下，Ptch1 抑制SMO的激活，但当Hedgehog信号在配体与Ptch1结合时被激活，导致SMO激活胶质瘤相关癌基因（glioma-associated oncogene，Gli）蛋白，然后Gli蛋白以激活的GLI2和GLI3蛋白的形式转移到细胞核，诱导Hedgehog靶基因的表达，使转录激活因子Gli1（GLI family zinc finger 1）活性增加，抑制了受体相互作用蛋白激酶3及NLRP3的激活，减轻小鼠HIRI中坏死性凋亡及炎症的作用，而Gli1 的缺失则促进了免疫细胞的激活和组织炎症[31]。Sheng等[32]发现Hedgehog/SMO/Gli1信号通过Gli1和胞内结构域（notch intracellular domain，NICD）之间的直接相互作用来控制在小鼠HIRI模型中NLRP3驱动的肝脏炎症。

2.4 Notch

Notch通路与细胞生长、分化和存活密切相关[33]，在炎症反应中，Notch信号通路在调节免疫细胞的发育和功能中发挥着重要的作用。Notch的经典通路为Notch被γ分泌酶切割，释放NICD，NICD移位到细胞核内，与RBPJ（recombinant recognition sequence binding protein at the Jκ site）形成复合物，并激活其靶基因Hes1（hairy and enhancer of split-1，Hes1）。最近有研究证实Notch1可以在小鼠HIRI中被激活，Notch靶基因Hes1抑制JNK结合蛋白（JNK/stress-activated protein kinase-associated protein 1，JSAP1）介导的ROCK1（Rho-associated protein kinase 1）激活，抑制JSAP1 可减低PTEN，增强AKT活性，导致HIRI中TLR4信号的抑制，从而减少TLR4介导的免疫细胞的激活及促炎因子的产生。此外，Notch-Hes1轴抑制JSAP1依赖的ROCK1和Caspace-3活性，从而减少HIRI引发的肝脏炎症中肝细胞的凋亡和坏死[34]。Kageyama等[35]报道，Serelaxin通过激活Notch1信号通路在小鼠原位肝移植中，使小鼠HIRI损伤显著减轻。同时有研究报道，低温携氧机械灌注在小鼠心脏死亡后器官捐献肝脏的IRI中能够激活Notch1信号通路，减少炎症因子的释放及减轻氧化应激反应，从而减轻HIRI[36]。

3 HIRI的双向调节通路

HIRI的发生发展过程非常复杂，损伤性和保护性信号通路的作用机制都集中在对HIRI中炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等方面的调节，部分通路有损伤和保护双向调节作用。

JAK2/STAT3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3）通路介导炎症的发展，与心肌、脑、肾等组织的缺血再灌注有关[37-39]。在小鼠HIRI中Kupffer细胞产生多种炎症介质，如IL-1β、IL-6和TNF-α，在与肝细胞表面受体结合后，促进JAK2 的激活，STAT3 在收到JAK2 的信号后，磷酸化形成二聚体，当二聚体入核后会再结合辅助因子和协作转录因子启动转录，进而调控HIRI中细胞凋亡及自噬等过程[40]。Sima等[41]发现七氟醚可以通过激活JAK2/STAT3 通路抑制HIRI中线粒体通透性转换孔的过度开放，降低肝脏免疫性炎症相关反应，进而使大鼠HIRI减轻。由于在该信号通路中STAT3α和STAT3β的表达水平为4∶1，因此许多研究都忽略了STAT3β的作用，将STAT3α视为STAT3的研究[42-43]。Cheng等[40]报道，培马贝特通过调节JAK2/STAT3β/PPARα通路，使p-STAT3β水平升高激活PPARα，抑制炎症因子的释放，并抑制细胞死亡，减轻小鼠HIRI损伤。因此JKA2/STAT3信号通路在HIRI过程中通过STAT3 表现出了双向调节的作用，这可能与p-STAT3β：p-STAT3α异源二聚体和p-STAT3α：p-STAT3α这两种不同形式的入核二聚体有关。

越来越多的研究表明不同的通路中存在相互联系的作用过程及病理生理机制。比如在HIRI的损伤性相关通路中激活的TLR4、NF-κB、NLRP3，可以在HIRI的保护相关通路中抑制它们的激活，甚至在同一通路中不同的作用过程拥有着截然相反的作用。因此，在调节HIRI过程中，在抑制损伤性相关信号通路、激活保护性相关信号通路的同时，应该将多种不同方向的通路联系起来，为减轻HIRI提供更多的研究方向以及为临床转化提供更多的思路。

4 HIRI中信号通路间的相互作用

信号通路间的交叉调控已在慢性炎症、肿瘤、免疫之间中有研究，不同通路信号间可能存在大量关联和交叉的信号分子。最近有研究表明在HIRI中同样有来自损伤性相关通路与保护性相关通路两条通路间的交叉调控的作用。

4.1 髓系FoxO1-β-catenin轴和Hedgehog/Gli1信号

FoxO1（forkhead transcription factors of the O class 1）转录因子是一种进化保守的细胞代谢、氧化应激、炎症和凋亡调节因子[44]。Hedgehog/Gli信号的激活可以调节细胞的生长、分化和免疫功能。有研究表明，FoxO1 与β-catenin信号协同调控肝缺血再灌注损伤中小鼠肝脏中的Hedgehog/Gli1/Snail通路，肝缺血再灌注可诱导JNK磷酸化，使核FoxO1增加[45]。此外，肝缺血再灌注激活了AKT，促进了β-catenin的核转位。在肝缺血再灌注损伤的炎症反应中，FoxO1与T细胞因子竞争与β-catenin相互作用，使β-catenin信号转导受到抑制，进而起到抑制刺猬信号通路的表达。实验证明小鼠HIRI中髓系FoxO1缺乏消除了FoxO1 与β-catenin的相互作用，增强了β-catenin的活性，促进了Hedgehog/Gli1/Snail信号转导，从而减轻了NEK7/NLRP3（NIMA-related kinase 7/NLRP3）介导的肝脏炎症和RIPK3（reduced receptorinteracting protein kinase 3）介导的坏死性凋亡[45]。

4.2 髓系HSF1-β-catenin轴和XBP1

热休克转录因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）是热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）的转录因子，可促进细胞的增殖和存活，减轻应激损伤[46]。X框结合蛋白1（X-box-binding protein 1，XBP1）是内质网应激的关键组成部分，是炎症反应中促炎细胞因子持续产生所必需的[47]。最近有研究证明HSF1-β-catenin轴通过调控XBP1 信号通路在小鼠HIRI中的激活来调节NLRP3 的功能。HSF1在HIRI中从含有HSP40/70 或HSP90 的多聚体蛋白质复合物中释放出来并转移到细胞核，诱导增加β-catenin转位和活性，从而抑制巨噬细胞对TLR/TRAF6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）刺激反应中XBP1的激活。抑制XBP1的活性会降低NLRP3的功能，导致Caspase-1的活性降低，使小鼠HIRI的IL-1β的成熟和分泌受到抑制，减轻HIRI中炎症反应[48]。

随着研究的不断深入，越来越多的信号通路被发现存在于HIRI中。而目前大多数的研究并没有详细阐述各通路之间的相互作用以及相互之间如何发挥调控作用。上述在HIRI中相关的损伤通路与保护通路的串扰表明不同通路之间可能存在交叉，而要了解不同通路之间的交叉调控就需要发现其中的关键靶点，比如HIRI中损伤性相关通路FoxO1-βcatenin和保护性相关通路Hedgehog/Gli1 通路之间的关键靶点β-catenin；以及HIRI中保护性相关信号通路HSF1-β-catenin和损伤性信号通路XBP1通路之间的关键靶点XBP1。因此为了进一步了解及调控HIRI，需要对不同通路间的相互联系及关键靶点进行更加深入和全面的研究，通过激活或者抑制关键靶点，更加精准的减轻HIRI。

5 小结与展望

综上所述，HIRI机制复杂，涉及多分子多通路的参与，不同的信号通路通过调控不同的HIRI机制发挥着不同的作用。其中起到促损伤效应的有HIPPO/YAP信号、HMGB1/TLR4信号、ALOX2信号、mTOR/S6K/HIF-1α信号转导通路；起到保护效应的包括HO-1-SIRT1-p53信号、WNT信号、刺猬信号、NOTCH信号转导的通路；起到双向调节效应的有JAK2/STAT3信号。不仅如此，不同信号通路之间可存在着大量信号分子交叉和关联，使这些连接不同通路间的关键因子成为当下研究的热点。即便是已知的信号通路中还包含着许多的未知相互作用因子，需要我们去深入研究。不论是HIRI的保护性相关信号通路或者损伤性相关信号通路都主要集中于调控HIRI中的炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等方面，因此为了更加有效的实现减轻HIRI我们应该重点关注能够调控上述病理机制的信号通路。同时越来越多的实验证明在HIRI中存在焦亡、铁死亡、坏死性凋亡等多种损伤机制，我们下一步研究也可以尝试联合多种机制去减轻HIRI。然而目前HIRI的研究多局限于动物体内外实验阶段，在临床效果还有待进一步的研究验证。随着生物标记技术，蛋白组学，纳米技术等多学科发展及相互应用，对HIRI通路的研究逐渐深入，通过抑制相关促损伤通路的靶点阻断剂或通过激活相关保护效应通路的激动剂的研发即将开拓出新领域。加强多学科的研究合作，我们期盼着减轻HIRI的新疗法，并尽快应用到临床当中，提高HIRI相关患者的预后。