中草药对畜禽细菌的体外抑制效果研究

唐冰璇，陈 娴，蒋海燕，曾 奥

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

中草药是天然药物，因其低残留、毒副作用小和抑/杀菌效果明显且不易产生抗药性，有些还能提高养殖动物的免疫功能和抗病能力，从而备受人们的关注[1-3]。如板蓝根[4-5]、金银花[6-7]和黄连[8-10]等具有提高动物细胞分泌干扰素、提高免疫细胞及肝脏网状内皮系统吞噬作用的功效，因而能有效地抑制病毒的复制；黄芩[11-12]等对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌和溶血性链球菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有杀灭和抑制作用等。国内已有学者研究发现中草药对畜禽养殖的常见致病菌具有不同程度的抑菌作用。因此，该部分研究对26种中草药对畜禽养殖中4类致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和巴氏杆菌)的抑制作用进行检测，为进一步研究开发用于畜禽养殖的中草药发酵制剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用中草药

板蓝根、地榆、藿香、防风、金银花、艾叶、丹参、乌梅、贯仲、五味子、马齿苋、虎杖、秦皮、鱼腥草、柯子、下青叶、夏枯草、五倍子、黄芩、黄连、黄芪、大黄、连翘、柴胡、黄柏、山楂购买自养天和药店。

1.1.2 试验菌株

实验中用到的细菌由本院实验室从畜禽中分离和鉴定，包括致病菌大肠杆菌DH5α、产毒大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、低毒巴氏杆菌（巴氏杆菌439）、中毒巴氏杆菌（巴氏杆菌2010）和强毒巴氏杆菌（巴氏杆菌2011），以及生理菌株副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌。

1.1.3 培养基

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和巴氏杆菌用LB培养基培养；金黄色葡萄球菌和沙门氏菌用营养肉汤(含2%NaCl)培养；副干酪乳杆菌用MRS培养基培养。所有培养基均购自广东环凯生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中草药制备方法

各药物超微粉的制备：采用BFM-T6BI型贝利粉碎机分别对药物进行粉碎，在-10℃～15℃下粉碎15min，过200目筛，即得各味药物超微粉体。

采用超微药物浸提法提取中药的有效成分，分别取板蓝根、藿香等26味超微中草药20g，各加入无菌蒸馏水200 mL浸泡24 h，药液过滤，再将滤液经旋转蒸发仪减压浓缩至20mL，此时各超微药物的最终浓度为1 g/mL。将得到的超微药液经高压灭菌锅121℃灭菌15 min后，4℃保存，备用。

1.2.2 菌悬液的制备

受试致病菌株复苏后分别接种于斜面培养基上,28℃培养24 h,用无菌生理盐水洗脱,至菌悬液浓度为107CFU/mL，备用。

1.2.3 培养基扩散法

取致病菌菌悬液100 μL涂布于固定培养基平板上,然后在培养基上打孔,

孔径约5 mm,孔间距离≥2 cm,向孔中注入中草药药液(每孔注入50 μL),每个试验组设3个平行组,置28℃生化培养箱培养24 h后观察抑菌圈大小(游标卡尺检测圈直径)。抑菌圈直径≥20 mm为极度敏感：++++；15 mm≤抑菌圈直径＜20 mm为高度敏感:+++；10 mm≤抑菌圈直径＜15 mm为中度敏感：++；无抑菌圈或抑菌圈直径＜10 mm为低敏或耐药：+。

1.2.4 二倍稀释法

根据抑菌圈结果，采用常量肉汤二倍稀释法测定中药超微药液最低抑菌浓度，每种中药超微药液取10支试管，每管加入1 mL菌悬液和9 mL肉汤和药物原液的混合液，配制成1 g/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5mg/mL、31.25 mg/mL、15.62 mg/mL、7.81mg/mL、3.91 mg/mL以及0 mg/mL（不加药液对照）药物浓度的混合液体培养基，28℃培养24 h，以浊度为指标检查试管中有无细菌生长，以不显示浊度、细菌不生长的那一管的超微药液浓度作为MIC值。

2 结果与分析

2.1 26种中草药对致病菌的抑制效果

如表1所示，26种中草药对大肠杆菌（DH5α为工程菌，产毒大肠杆菌为致病菌）的抑菌效果，地榆、防风、乌梅、五味子、黄连对两种大肠杆菌均表现出一定的抑菌效果，其中贯仲、柯子和大黄还对产毒大肠杆菌属有抑菌效果。由此也可看出，同一中草药对同一属不同种细菌的抑制效果存在差异，DH5α的耐药性强于产毒大肠杆菌。

表1 26种中草药对大肠杆菌的抑菌效果

如表2所示，26种中草药对巴氏菌属的抑菌效果(3种菌均为致病菌)，地榆、防风、乌梅、柯子、五倍子、大黄、连翘和山楂均对巴氏杆菌有抑制作用，其中贯仲和柴胡对巴氏杆菌439；黄连和黄柏对巴氏杆菌439和巴氏杆菌2011也表现出抑菌效果，因此可得出在耐药性方面：巴氏杆菌2010＞巴氏杆菌2011＞巴氏杆菌439。

表2 26种中草药对巴氏菌属的抑菌效果

根据表3结果，地榆、防风、乌梅、贯仲、五味子、柯子、五倍子、黄连、大黄和山楂对两属致病菌均表现出抑制作用，同时，丹参、黄芩、黄连、连翘、柴胡对金黄色葡萄球菌也具有抑制作用。金黄色葡萄球菌相对较为敏感，其中乌梅、五味子和大黄对金黄色葡萄球菌的MIC分别达到62.50 mg/mL、62.5 mg/mL和31.25 mg/mL。

表3 26种中草药对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制效果

与前面的致病菌不同，副干酪乳杆菌为益生菌，枯草芽孢杆菌为一种无致病性的安全微生物，两种菌均可用于开发畜禽养殖中草药发酵制剂。由表4可知，板蓝根、地榆、柯子、五倍子、黄连和大黄对副干酪乳杆菌表现出一定的抑菌效果，地榆、丹参、乌梅、五倍子、虎杖、五味子、黄连、大黄和连翘对枯草芽孢杆菌具有抑制作用。

表4 26种中草药对副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果

3 讨论

有关中草药在畜禽养殖方面应用已有诸多报道，曲径等[13]报道显示，艾叶、黄连、黄柏、地榆、柴胡对巴氏杆菌均有抑制作用，这与本研究结果类似，不同之处在于艾叶的抑制效果，其原因可能是艾叶起抑制效果的有效成分易溶于醇，而水提难以溶出其有效成分；其次，本研究结果显示，而巴氏杆菌2010对黄连黄柏表现出极强的耐药性，说明黄连黄柏的抑制效果对同一属不同种和不同株的巴氏杆菌存在差异，巴氏杆菌2010如此强的耐药性有待于进一步的研究。

乳酸菌作为益生菌，同时乳酸菌本身也具有抑制其他细菌生长的作用，一般鲜有报道中草药对乳酸菌的抑制效果[14]。本研究结果显示，具有较强抑制作用的中草药（柯子、五倍子、黄连、大黄和黄柏）同样对乳酸菌具有抑制作用，但相对于其他菌，能够抑制乳酸菌生长的中草药较少。该结果可为乳酸菌和中草药的合理应用提供依据。

4 结论

综述上述结果，大青叶、夏枯草、黄芪、秦皮、鱼腥草、马齿苋、艾叶、金银花、藿香和板蓝根对被检致病菌没有抑制效果；地榆、防风、乌梅、五倍子、五味子、柯子、山楂等对各致病菌均有抑制效果。结合中草药对枯草芽孢杆菌和副干酪乳杆菌的抑制效果，可选择贯仲、黄芩和柴胡这一类（对致病菌具有抑制作用，而对无毒菌株无抑制作用）中草药，抑或选择大青叶、夏枯草、秦皮、鱼腥草、马齿苋、艾叶和金银花（对致病菌和无毒菌株均无抑制作用）用于开发畜禽养殖中草药发酵制剂，这些结果为后续枯草芽孢杆菌和副干酪乳杆菌发酵中草药研究提供参考。