宏基因组二代测序在伴有中枢神经系统受累儿童噬血细胞综合征中的应用价值

张海洋 唐茂婷 卿露 李德渊 乔莉娜

（四川大学华西第二医院儿童重症医学科/出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，四川成都 610041）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）为疱疹病毒科γ亚科，是一种嗜人类淋巴细胞的疱疹病毒，在正常人群中感染非常普遍，90%以上的成人血清EBV抗体呈阳性。原发性EBV感染典型表现为传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM），在婴幼儿中也可为无症状或其他不典型临床表现。噬血细胞综合征（hemophagocytic syndrome，HPS）是一类儿童高发的系统性高炎症反应综合征，临床特点为细胞因子风暴引起的过度炎症反应导致的脏器损伤，其起病急，进展迅速，严重者未经及时治疗可发展为多器官功能衰竭，危及生命。感染可引起原发性或继发性HPS，致病微生物以EBV最多见，EBV感染的不同状态均可引发HPS［1］。HPS易合并中枢神经系统危急症状，常为暴发性疾病，预后极差［2］。既往经验可以印证HPS产生的炎症风暴可使颅内受累，但颅内病理生理状况未知，无法区分免疫风暴或EBV感染引起的病毒性脑炎。疑似中枢神经系统感染的病例应尽早进行脑脊液检查以明确诊断，而目前儿童EBV相关HPS的治疗指南均未提及对颅内EBV感染的检测［3-4］，传统EBV检测手段存在诸多局限性［5-7］，且聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测脑脊液EBV-DNA的灵敏度尚未有确切的临床数据。

宏基因组二代测序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）技术是基于基因组学的病原学检测技术［8-9］，其无需培养、无需预判，且效率高，大部分检测机构能在24 h内出具报告，能精准识别感染的病原体，已广泛在危重、复杂的脑炎、脑膜炎的诊断中应用［10-12］。在过去的二十年里，尽管病原体特异性检测（如PCR病毒核酸检测和特异性抗体检测）取得了一定进展，但脑炎患者的诊断率仍然很低［13］。本研究采用mNGS检测有中枢神经系统受累症状的HPS患儿的脑脊液，寻找此类患儿颅内EBV感染的依据，以明确EBV相关HPS是否容易诱发EBV感染引起的病毒性脑炎。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2020年1月—2022年4月我院儿童重症监护室（pediatric intensive care unit，PICU）收治的EBV相关HPS患儿30例。纳入标准：（1）符合2004年HPS诊断标准（HLH-2004）及《噬血细胞综合征诊治中国专家共识》的诊断标准［1，3-4］；（2）血 清EBV-DNA>400拷 贝/mL；（3）伴有中枢神经系统症状；（4）脑脊液mNGS检出EBV。排除标准：资料不完善或失访者，无明确临床诊断者。所有患儿监护人均知情同意，本研究通过我院伦理委员会批准（医学科研-2021-申181）。

1.2 生化检测

脑脊液的采集：入院72 h内通过腰椎穿刺术抽取脑脊液约5 mL，存放于低吸附无菌采样管，采样过程严格控制无菌，采集后立即送检mNGS和PCR检测。

血清学检测：采集初次拟诊为伴有中枢神经系统受累患儿的外周静脉血，分别行血常规、肝肾功能、铁蛋白、凝血功能、血脂、脑脊液EBVDNA定性检测、血清EBV-DNA定量检测及血清EBV抗体谱检测。血清EBV-DNA≥1×103拷贝/mL可视为异常［14］。

脑脊液PCR检测：取200 μL脑脊液样本提取DNA，采用实时荧光PCR分析（荧光定量Q5，赛默飞，美国），对检测结果进行确认（脑脊液PCR操作及质控须符合院内标准操作规范的要求）。

1.3 mNGS方法

DNA提取与质控：取200 μL脑脊液样本于室温下5 000 r/min离心10 min取上清液，使用天根核酸提取试剂盒（DP316，北京天根生化科技有限公司）提取上清液中的DNA并完成纯化，每批样本检测设置不添加任何微生物的阴性对照，以及加入混合菌的阳性对照，用Qubit 2.0（Thermo Fisher，美国）和琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA含量，进行质控。参照DNA文库构建试剂盒（Illumina）操作手册，在待测DNA片段两头加上能与测序仪器识别的已知序列片段，进行扩增与富集，采用Agilent 2100 Bioanalyzer（安捷伦，美国）完成文库质控。在Illumina二代测序平台Nextseq 550Dx上进行75 bp单端高通量测序。

1.4 生物信息学分析与阳性标准

使用Fastp软件去除原始数据中低质量、重复、冗余片段及接头序列，获得高质量数据，通过Bowtie2比对人源参考基因组数据库去除人源宿主序列，未比对上的数据与自建微生物（包括细菌、真菌、支原体、病毒和寄生虫）数据库进行鉴定。

mNGS检测的阳性标准：一般情况下认为正常人脑脊液是绝对无菌的，检测到微生物即考虑为病原体检出，将检出序列数≥3定为结果阳性。

1.5 统计学分析

采用 SPSS 25.0统计软件进行数据处理分析与图形绘制。计量资料以中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，计数资料以例数和率（%）表示，率的比较采用卡方检验。相关性分析采用Spearman秩相关，采用多元线性回归方法分析影响脑脊液mNGS EBV检出序列数的临床指标。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 30例患儿的临床资料

30例患儿中位年龄为3.0（0.7，6.5）岁，骨髓涂片均有噬血现象，其中2例有家族性噬血基因。患儿均表现出烦躁不安、抽搐、嗜睡等神经系统症状，合并脑脊液白细胞及蛋白水平正常或轻度增高，脑脊液mNGS EBV检出序列数均大于3，均诊断为病毒性脑炎［15-16］。其他临床资料见表1。

表1 30例伴有中枢神经系统症状的HPS患儿的临床资料

2.2 30例患儿血清EBV抗体谱结果

30例患儿VCA-IgG、EBNA-IgG均为阳性，其中2例（7%）VCA-IgM阴性，提示既往感染，为检测阴性结果；28例（93%）VCA-IgM阳性，提示原发感染晚期或再激活，为检测阳性结果。3例（10%）患儿VCA-IgG为低亲合力抗体，提示原发性急性感染［17］；3例（10%）VCA-IgA阳性，是近期感染、感染再激活或慢性反复持续性感染标志［18］。

2.3 脑脊液mNGS EBV检测结果

mNGS检出EBV序列数最高为28 880，最低为43，中位检出序列数为2 400（420，1.3×104）。检出序列数40~1×103有10例，1.1×103~1×104有11例，超过1×104有9例。

2.4 脑脊液mNGS与EBV传统检测结果比较

脑脊液mNGS EBV检测阳性率为100%（30/30），脑脊液EBV-DNA定性检测阳性率为10%（3/30），血清EBV抗体谱检测阳性率为93%（28/30）。脑脊液mNGS EBV检测阳性率高于脑脊液EBV-DNA定 性 检 测 阳 性 率（χ2=49.091，P<0.001），而脑脊液mNGS EBV检测阳性率与血清EBV抗体谱阳性率比较差异无统计学意义（χ2=0.517，P=0.469）。

将mNGS EBV检出序列数与患儿年龄、血清铁蛋白、脑脊液蛋白、脑脊液白细胞数、治疗前血清EBV-DNA拷贝数等指标进行相关性分析，发现治疗前血清EBV-DNA拷贝数与EBV检出序列数呈中度正相关（rs=0.693，P<0.001），见表2。

表2 EBV检出序列数与临床指标的相关性分析

将以上数据进行多元线性回归分析，徳宾·沃森值为2.602，共线性方差扩大因子均小于2.5，说明以上参数相互之间独立。结果显示，治疗前血清EBV-DNA拷贝数越高，脑脊液mNGS EBV检出序列数越高（P=0.017）。见表3。

表3 多元线性回归分析结果

2.5 治疗前后血清EBV-DNA拷贝数变化

根据mNGS结果，患儿接受阿昔洛韦［10 mg/kg，8 h 1次］抗病毒与地塞米松或甲泼尼龙+足叶乙甙治疗。治疗前血清EBV-DNA拷贝数中位数为28 050（7 808，1.04×105），针对性治疗后患儿血清EBV-DNA拷贝数均下降，中位数为875.0（436.0，1892.5），仅2例 患 儿 治 疗 后EBV-DNA拷贝数仍超过6.0×104，该2例患儿治疗结局均为死亡。

3 讨论

本研究采用mNGS检测30例伴有中枢神经系统受累的HPS患儿脑脊液，提供HPS患儿颅内EBV感染证据。病毒的分离与鉴定是病毒病原学诊断的金标准，但病毒寄生于活细胞中，分离鉴定困难，并且耗时长。EBV是导致亚洲幼儿HPS的重要因素，HPS病情暴发迅速，进展快，严重影响初发或复发患儿预后。早期诊断、提前干预对降低患儿病死率至关重要，但关于HPS颅内EBV感染的研究未见报道。

mNGS作为在儿童危急重症中应用时间尚短的一门检测技术，相比血清EBV-DNA拷贝数更能发现颅内受累证据，极大地避免了漏诊、误诊，降低患儿病死率的同时提高生存质量。关于抗病毒疗程的制定，或将不依赖血清EBV-DNA拷贝数下降指数判定，其陡然下降并非能代表体内全部EBV的有效清除，也需参考脑脊液mNGS EBV检出序列数情况。脑脊液是一种绝对无菌的体液，脑脊液中病原体载量低，PCR扩增具有偏向性［19-20］，故脑脊液PCR检测可能引起漏检，mNGS能更精确地发现HPS患儿颅内EBV感染的证据，为早期干预、制订更加完善的抗病毒治疗方案提供借鉴。

本研究也存在一些局限性，首先，病例数量偏少，患儿年龄差距较大，数据统计未排除因实验设计带来的一些偏差；其次，单中心检测结果有待于多中心研究结果验证，阐明颅内EBV感染对儿童HPS产生、发展的影响；最后，患儿好转后未进行脑脊液mNGS复测，后续随访数据有待于继续研究。

综上，本研究通过mNGS发现EBV在HPS患儿引起颅内感染的证据，并以血清EBV抗体谱、治疗前后血清EBV-DNA拷贝数作为参照，证明EBV相关HPS容易诱发EBV感染引起的病毒性脑炎，但有待于多中心更大数据研究验证。

志谢：感谢迪飞医学科技（南京）有限公司对本研究的支持。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。