猪源Pdm/09 H1N1甲流NA定点突变拯救毒株的生物特性研究

程 倩,孔子荣,,李三木,李 献,Muhammad Junaid,张书祥,何奇松,熊 毅,孙文博,颜健华

Pdm/09 H1N1流感病毒传入我国后严重危害到了公共卫生安全,其极强的跨物种间传播能力以及与猪群中的类禽型H1N1猪流感病毒重组产生的新型毒株始终对人类健康具有较大威胁性,因而对Pdm/09 H1N1流感病毒的研究具有重要意义[1-5]。反向遗传学技术对流感病毒的研究具有重大意义,流感病毒的反向遗传学技术,目前应用最广泛的为Hoffmann等建立的双向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ转录系统,即8质粒系统[6-10]。反向遗传学技术在流感病毒研究上的广泛应用,对流感病毒跨种属传播机制、新型疫苗制备和流感病毒基因组的结构和功能探索有着重要意义。在流感病毒基因功能研究中,通过定点突变可以探究位点对宿主致病力、病毒复制能力、病毒传播机制、耐药性和病毒传播机制的影响。本研究将利用定点突变技术突变已有反向遗传学体系中的NA基因119位点并拯救成功,为后期研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 质粒 猪源Pdm/09 H1N1流感病毒株A/swine/Guangxi/12/2011(H1N1)、pBD-PB2、pBDPB1、p BD-PA、p BD-HA、p BD-NP、p BD-NA、p BDM、pBD-NS的8质粒反向遗传学体系由广西大学医学院颜健华博士惠赠[11]。

1.1.2 试验动物和细胞 SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。犬肾细胞MDCK(Madin-Darby Canine Kidney cells)和人胚胎肾细胞293T由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心保存;SPF级BALB/c 6周龄雌性小鼠(约20 g/只),购自北京维通利华公司。

1.1.3 试剂 X-gal溶液(20 mg/m L)、IPTG溶液(50 mg/m L)、氨苄、青霉素、链霉素、Hank’s洗液等均购自北京索莱宝公司;Fast Site-Directed Mutagenesis Kit快速定点突变试剂盒、质粒大量提取试剂盒(无内毒素)、病毒总RNA抽提试剂盒等购自北京天根公司;组织固定液购自武汉塞维尔公司;神经氨酸酶检测试剂盒等购自碧云天公司;含LGlutamine的Opti-MEM细 胞 培 养 液、DMEM、0.25%EDTA胰酶以及胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;转染试剂盒购自Invitrogen公司;MMLV反转录酶、RNase酶抑制剂、小量质粒抽提纯化试剂盒、胶回收试剂盒等购自宝生物公司;1%鸡红细胞悬液由实验室制备。

1.2 引物设计与合成 试验所需的流感病毒神经氨酸酶基因定点突变、测序以及流感病毒鉴定引物利用Primer 5和Oligo 8设计,Uni12为流感病毒反转录引物,序列见表1。

1.3 基因定点突变 参考天根公司Fast Site-Directed Mutagenesis Kit快速定点突变试剂盒操作方法利用PCR方法直接在pBD-NA质粒上进行定点突变,PCR体系50.0μL:p BD-NA质粒0.2μL,正向、反向突变引物各2μL,5×Fast Alteration Buffer 10μL,1×Fast Alteration DNA Polymerase 1μL,RNase-Free dd H2O补足至50.0μL,反应程序:95℃5 min;94℃30 s,55℃1 min,68℃5 min,30个循环,68℃5 min。按突变试剂盒说明书进行突变质粒模板消化以及转化,然后将所有菌液涂布到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基(涂布20μL 0.2 mol/L的IPTG和40μL 40 mg/m L的X-gal)上,将平板置于室温直至液体被吸收后倒置平板,37℃培养过夜,挑选蓝斑扩增后进行菌液PCR测序鉴定,反应体系25.0μL:菌液1.0μL,10ⅹbuffer 2.5μL,d NTP(2.5 mmol/L)2.0μL,rTaq酶0.5 μL,上、下 游 引 物 各1.0 μL,RNase-Free dd H2O补足至25.0μL。反应程序为95℃5 min;94℃45 s,56℃45 s,72℃90 s,30个 循 环;72℃10 min。最后进行1%浓度琼脂凝胶核酸电泳并回收目的条带的cDNA测序。对测序正确的阳性菌液加入到50 m L LB培养液(含AMP 50μg/m L)中置摇床中摇菌过夜后提取获得质粒。

1.4 病毒拯救与鉴定 将状态良好且可以传代的293T细胞和MDCK细胞经胰酶消化后按细胞量3∶1的比例(细胞数量为105个/m L)共同铺板至25 mm直径的培养皿中,于37℃、5% CO2细 胞培养箱中培养至单层细胞密度约70%～80%,然后将流感病毒8质粒系统改变pBD-NA质粒,分别拯救r MT(NA119G)和r WT(NA119E)。流感病毒拯救方法如下:吸取240μL含L-Glutamine的OPTIMEM到2.0 m L离心管,依次加入含1μg流感病毒各基因片段质粒,轻轻吹打混匀;吸取240μL OPTI-MEM到另1个2.0 m L离心管,加入12μL Lipofectamine TM2000,轻柔吹打充分混匀,室温静置5 min;将后者缓慢转移至混合质粒中,轻柔吹打10余次充分均匀混合,室温作用30 min形成DNALF 2000混合物;将混合铺板293T细胞和MDCK细胞的培养皿用巴氏吸管吸取Hank’s液洗板3次,去除培养基中血清,再用巴氏吸管从中心位置缓慢滴加480μL/孔的DNA-LF 2000混合物至准备好的培养皿中,于细胞培养箱培养20 h后吸去上清,更 换 为 含0.5 μg/m L TPCK胰 酶 的OPTIMEM细胞培养液2 m L,继续培养48 h,每12 h观察1次细胞状态,转染换液并培养48 h后将培养皿上的细胞吹下,细胞悬液混匀后将其接种孵育9 d龄SPF鸡胚,200μL/枚,继续孵育60 h,收取鸡胚尿囊液进行血凝试验(HA)和PCR鉴定。鉴定为阳性的鸡胚尿囊液通过细胞培养、纯化后,再接种SPF鸡胚,收获鸡胚尿囊液,分装、－80℃保存,作为种毒备用。

1.5 PCR鉴定 使用天根公司病毒总RNA提取试剂盒来提取流感病毒的RNA,操作步骤按说明书进行,然后使用反转录引物Uni12合成c DNA,体系混合均匀后,放入PCR仪中42℃反转录1 h、95℃5 min。反应结束后,取反转录结束后的使用鉴定引物对样品c DNA进行PCR反应,使用56℃退火45 s。PCR体系为:2.5μL 10×Trans Taq HiFi Buffer(含Mgcl2),2.0μL d NTP mix,各0.5μL Id-F与Id-R,0.5μL Trans Taq HiFi DNA Polymerase,5.0 μL cDNA Template,14μL dd H2O,扩增片段,进行电泳,胶回收目的条带送测序。

1.6 病毒生长曲线 分别以100个TCID50(MOI＝0.001)的剂量将拯救株及突变株病毒分别接种于12孔板中状态良好且单层的MDCK细胞,然后在不同的时间点12 h、24 h、48 h和72 h分别收集细胞上清,每个时间点设3个重复,观察CPE,按照Reed&Muench公式计算TCID50值。

1.7 神经氨酸酶活性测定 取HA滴度最高的获救病毒细胞毒6份分装的种毒进行试验,操作步骤按碧云天神经氨酸酶活性检测试剂盒说明书进行,检测体系如表2。

表2 神经氨酸酶活性检测体系Tab.2 Neuraminidase activity detection system

按说明书所示顺序及上表配制体系,37℃孵育30 min后,以450 nm发射波长进行荧光测定,再根据监测出来的荧光强度对比阳性及阴性对照,计算样品中神经氨酸酶的相对活力。正式试验前需进行预实验,以确定最佳孵育时间。

1.8 神经氨酸酶二级结构预测 登录泰德生物网站(http://www.detaibio.com/tools/chou-fasmanforecast.html),输入NA蛋白质推导的氨基酸序列,使用Chou-Fasman算法在线预测神经氨酸酶二级结构。

1.9 致病性试验

1.9.1 攻毒实验 随机将6周龄雌性BALB/c小鼠分为3组,分别空白对照、r MT组和r WT组,每组8只健康小鼠。用干冰将BALB/c小鼠轻度麻醉后,空白对照组每只小鼠鼻腔滴鼻接种50μL PBS液;r MT组每只小鼠经鼻腔滴鼻接种r MT病毒稀释液50μL(病毒含量为106TCID50);r WT组接种r WT病毒稀释液50μL(病毒含量为106TCID50)。接种后继续饲养14 d,记录小鼠体重、存活数量和临床症状,并计算小鼠攻毒不同毒株后的存活率。

1.9.2 组织切片 在第3天随机无菌剖解攻毒组和对照组小鼠各2只,取脑、肾脏、脾脏、肺脏并分装至5 m L灭菌的EP管中,一部分加入适量的组织固定液,组织切片送由广西医科大学完成;另一部分进行组织病毒滴度测定。

1.9.3 组织病毒滴度检测 取出第3天随机剖取的脏器标记称重,按照g/m L的比例加入4℃预冷的接毒液和灭菌过的钢珠,2000 r/min在组织研磨仪中研磨1 min,然后8000 r/min,4℃离心1 min,无菌快速吸取上清,倍比稀释接种在长好单层细胞密度约80%的MDCK细胞的96孔板上,放置进细胞培养箱培养,详细测定流程如下。

1.9.3.1 细胞铺板 将T25细胞瓶中生长状态良好单层细胞密度约80%的MDCK细胞经胰酶消化和完全培养基稀释,以100μL/孔加入至96孔细胞培养板,上下摇动后于37℃细胞培养箱培养过夜。

1.9.3.2 病毒稀释 在另一置于冰面上的96孔板进行,第一列加入病毒原液每孔200μL,第2到12列中每孔加入病毒稀释液180μL/孔,从第一列吸取20μL病毒液加至第2列混匀,然后倍比稀释至第11列,第12列作细胞对照。

1.9.3.3 接种病毒 吸取稀释病毒板每孔100μL转移至Hank’s液洗过的铺板MDCK细胞的96孔板,然后置于细胞培养箱中继续培养48 h。

1.9.3.4 结果计算 从接种病毒的96孔板中每孔吸取50μL上清液按方法1.5测定血凝价,按照根据Reed&Muench公式计算TCID50。

1.9.4 组织病毒含量检测 对所需检测的动物组织按照天根病毒总RNA抽提试剂盒进行抽提然后进行Real-time PCR检测。

2 结果

2.1 质粒定点突变结果 经过突变PCR和质粒消化后的质粒进行转化、涂板和蓝白斑筛选,挑选白色斑菌落进行扩大培养,再进行PCR鉴定,鉴定阳性的质粒进行基因序列测定。通过序列比对发现pBD-NA119G只在核苷酸第336位由A突变为G,使氨基酸位点发生E(核苷酸:GAA)到G(核苷酸:GGA)的变化,而其他位置的氨基酸均未发生改变,表明质粒定点突变成功,见图1。

图1 定点突变后测序r MT和r WT并对比Fig.1 Sequencer r MT and r WT after site-directed mutation and compare

2.2 血凝试验结果 转染后的细胞悬浮液接种MDCK细胞连续传代3代后血凝效价完全稳定,拯救的r MT血凝效价最高为27,r WT为26,见图2。

图2 r MT和r WT血凝试验结果Fig.2 Hemagglutination tests for r MT and r WT

2.3 PCR鉴定结果 将转染收获的细胞悬液反复冻融后进行用M基因片段引物进行PCR鉴定,阴性对照无电泳条带,阳性对照在700 bp位置出现条带,对照组均成立。r MT和r WT在700 bp位置均有条带出现,经测序得到684 bp核苷酸序列,NCBI比对后确认拯救出了H1N1亚型猪流感病毒,见图3。

图3 r MT和r WT M基因片段扩增结果Fig.3 Amplification of r MT and r WT M gene fragments

2.4 病毒生物曲线绘制 r MT与r WT相比,病毒复制能力有所增强,但差异不显著,主要表现在r MT 12 h至48 h时间段的复制速度略高于r WT 48 h后略有降低但相差不多,见图4。

2.5 神经氨酸酶相对活性测定 3份不同批次r WT病毒液在OD 450 nm处测量的光吸收值分别为0.1202、0.0993和0.1126,r MT病毒测量的光吸收值分别为0.1050、0.0944和0.0994,根据试剂盒所示算出样品活性,3批次同一批次同比下降约8.7%、9.5%、8.8%,神 经 氨 酸 酶 活 性 平 均 下 降 约9.0%,但变化差异无统计学意义(F＝0.315,P＞0.05),见图5。

图5 r MT和r WT神经氨酸酶相对活性检测Fig.5 Relative activity of neuraminidase for r MT and rWT

2.6 神经氨酸酶的二级结构预测 使用软件对神经氨酸酶的二级结构预测,结果见图6。r MT 111位点至119位点Alpha Helix分值(A图)分别为:0.96、0.89、0.95、0.96、0.93、0.88、0.85、0.79、0.82,均值为0.892。r WT 111位点至119位点的Alpha Helix分值(B图)分 别为:1.06、1、1.06、1.07、1.03、0.99、0.95、0.9、0.92,均 值 为0.998。r MT与r WT相比Alpha Helix分值明显下降,均值同比下降约为10.62%,经突变后的r MT Alpha Helix结构分值表现为下降趋势。

图6 r MT和r WT神经氨酸酶的二级结构预测Fig.6 Prediction of secondary structure of neuraminidase for r MT and r WT

2.7 攻毒小鼠临床症状、体重变化和存活情况 对照组小鼠均未出现死亡且体重呈持续增长趋势,而r MT与r WT攻毒小鼠后均不能致死小鼠,但攻毒组都会在第3 d出现明显的被毛凌乱临床症状,r WT攻毒组小鼠在第4 d和第5 d出现精神沉郁并伴有轻微的腹式呼吸,然后逐渐恢复,第8 d典型的流感后临床症状基本消失;r MT攻毒组小鼠在感染前期出现被毛凌乱,但能正常进食,第5 d均开始出现轻微腹式呼吸的症状,个别小鼠在第6 d会出现呼吸急促症状,但第2 d呼吸急促会有所减轻,多数小鼠在第9 d典型的流感临床症状会消失,临床症状记录表见表3。

表3 r MT与r WT攻毒小鼠的临床症状Tab.3 Clinical symptoms of r MT and rWT in mice

r MT与r WT攻毒小鼠后均会导致体重迅速下降(见图7),r WT组小鼠在第2 d开始明显体重下降,第4 d平均体重达到最低,平均体重下降率为9.1%,个体最大体重下降率为10.3%,第5 d体重开始逐渐恢复。r MT组小鼠第3 d开始明显体重下降,第6 d平均体重达到最低,平均体重下降率为9.9%,个体最大体重下降率为12.8%,第7 d体重开始逐渐恢复。第14 d r WT组小鼠基本恢复到原有体重水平,r MT组小鼠则比初始体重略低。

图7 对照r MT与r WT攻毒小鼠平均和个体体重变化情况Fig.7 Mean and individual weight changes in control,r MT and r WT exposed mice

2.8 组织病毒滴度 攻毒r WT和r MT病毒第3 d小鼠组织病毒滴度检测结果见图8,r WT攻毒组小鼠肺组织的病毒滴度为(5.12±0.35)log10 TCID50/g,鼻甲骨的平均组织滴度为(4.21±0.34)log10 TCID50/g;r MT攻毒组小鼠肺组织的平均病毒滴度为(5.51±0.30)log10 TCID50/g,鼻甲骨的平均组织滴度为(4.46±0.24)log10TCID50/g。攻毒组在肺组织和鼻甲组织中的病毒滴度相比差异无统计学意义(F肺＝0.219,F鼻＝0.278,均P＞0.05),r WT攻毒组鼻甲组织与肺脏中的病毒滴度相比差异有统计学意义(F＝3.071,P＜0.05),r MT攻毒组鼻甲组织与肺组织中的病毒滴度相比差异有统计学意义(F＝8.901,P＜0.01),表明突变后毒株不会明显改变对上呼吸道和下呼吸道的组织亲和性。此外,在r MT攻毒组的脾脏和肾脏组织中均检测到病毒的存在,而r WT攻毒组则仅在脾脏组织中检测出病毒。在脾脏组织中,r MT攻毒组组织病毒滴度为(0.87±0.35)log10 TCID50/g,r WT脾组织病毒滴度为(0.27±0.21)log10 TCID50/g,变化差异有统计学意义(F＝2.976,P＜0.05),在肾脏组织中,测得r MT脾组织病毒滴度仅为(0.20±0.17)log10 TCID50/g,r WT攻毒组病毒滴度为0。

图8 r WT和r MT攻毒小鼠组织病毒滴度Fig.8 rWT and r MT viral titers in mice

2.9 组织中病毒含量检测 攻毒r WT和r MT病毒第3 d小鼠组织进行实时荧光定量PCR检测结果见图9。2组小鼠脾脏和肾脏中均有病毒存在,r MT攻毒组组织中病毒含量都高于r WT攻毒组,其中脾组织高1.5倍左右病毒拷贝数量,差异有统计学意义(F＝2.702,P＜0.05);肾组织高2倍左右病毒拷贝数量,差异有统计学意义(F＝61.625,P＜0.001);攻毒组小鼠脑组织中均未检测到病毒的存在。

图9 r WT和r MT攻毒小鼠组织病毒含量检测Fig.9 Detection of virus content in tissues of r WT and r MT exposed mice

2.10 组织切片 根据组织中病毒含量的测定结果,我们对脾脏、肾脏和肺脏进行了组织切片检查。肺脏组织中的病变明显:对照组(图10A)肺脏组织细支气管形态结构未见明显异常,肺泡壁厚薄正常,形态结构未见明显异常,没有发现炎性细胞浸润;r WT攻毒组小鼠肺脏出现肺泡壁增厚和毛细血管淤血的现象(图10B),r MT攻毒组小鼠肺泡壁增厚和毛细血管淤血,同时肺泡腔变窄并伴随有少量中性粒细胞浸润(图10C)。结果显示空白对照、r WT和r MT攻毒组小鼠的脾脏(图10D、E和F)中,空白对照和r WT组未发现明显病变,r MT攻毒组白髓见少量淋巴细胞坏死(蓝色箭头)。肾脏(图10G、H和K)3个组的组织皮髓质分界清楚,肾小球形态结构未见明显异常,肾小管排列紧密,形态结构未见明显异常,未见明显炎性细胞浸润;r MT攻毒组(图10K)见静脉扩张,有淤血(黑色箭头)。

图10 对照r MT与r WT攻毒小鼠肺脏、脾脏、肾脏(HE染色,×200)Fig.10 HE staining of lungs,spleens and kidneys of control,r MT and r WT exposed mice(HE,×200)

3 讨论

流感病毒反向遗传学技术的应用对研究流感病毒的基因组结构和功能有着重要意义。NA蛋白的氨基酸变异可以影响神经氨酸酶抑制剂的药物敏感性、病毒释放以及协同作用的其他生物学特性,如致病性和病毒组织组织亲和性等。本研究中的2个获救毒株存在血凝效价的差异,这可能是在病毒复制过程中NA蛋白同HA蛋白的协同作用释放流感病毒步骤受到影响有关,突变后的NA蛋白经氨基酸二级结构预测发现111位点至119位点Alpha Helix分值明显下降,均值同比下降约为10.62%。其中,NA蛋白E119G的突变可影响到酶活性中心118位关键催化位点从而降低NA活性,这与H3N2亚型流感病毒在该位点的同等突变相似[12]。在突变对药物敏感性影响方面,现有主流抗流感药物有M2离子通道阻断剂、神经氨酸酶抑制剂以及中成药,NA蛋白酶活性中心有8个关键催化位点以及11个酶活性辅助位点,其中119E、152R、275H、293R、295N被认为是神经氨酸酶抑制剂药物敏感位点,发生突变后可影响毒株的药物敏感性,最新研究发现247位点的改变也能引起其对奥司他韦的耐药性。本研究中的H1N1亚型猪流感病毒发生E119G单位点突变是否会直接产生耐药性还有待进一步研究,值得注意的是,NA的耐药突变往往具有协同效应,如H274Y与S247N和I117V等突变的组合可导致病毒对奥司他韦的耐药性,而H3N2亚型流感病毒NA蛋白发生E119V和I222L双突变可产生对奥司他韦的耐药性[12]。此外,扎那米韦也是一种神经氨酸酶抑制剂,但毒性较大,已有研究表明NA蛋白发生E119G/A/D和R292K突变或者HA蛋白发生K68R、G75E、E114K、N145S、S165N、S186F、N199S和K222T突变时会产生耐药性,由于E119G突变产生耐药性已被证实以及使用流感治疗中使用扎那米韦的非必须性,因而本研究并未对r MT的扎那米韦耐药性进行重新验证。

在突变对致病性影响方面,在前期的研究中,我们发现1株对BALB/c小鼠致死率为100%的H1N1毒株,通过推导的氨基酸序列分析,与其它致病力弱的H1N1毒株主要氨基酸位点差异就是在NA基因上119位点发生了E119G的突变,推测HA蛋白Ca2抗原区发生V204D变异协同NA蛋白E119G变异可能是病毒抗原性改变和致病性增强的关键变异,因此我们利用r WT(HA蛋白Sb抗原区V204D变异)利用基因突变技术将NA蛋白119位点E替换成G后进行验证,结果发现r MT与r WT都没有引起小鼠死亡,但小鼠体重下降幅度增加,最大为12.8%,组织切片显示均在肺脏出现轻微炎症,说明HA蛋白Ca2抗原区发生V204D的变异可能才是病毒致病性改变的关键。另外,我们在检测小鼠组织病毒滴度和病毒含量中也发现了差异的存在,主要表现为r MT在脾脏组织和肾脏组织中的病毒含量较r WT明显升高,说明HA蛋白发生位于Sb抗原区的V204D变异协同NA蛋白E119G变异也可能增强病毒与小鼠的组织亲和性。猪流感病毒在自然情况下同时具有与SAα-2,6 Gal受体和SAα-2,3 Gal受体结合的能力,研究表明,BALB/c小鼠脾脏组织主要分布SAα-2,6 Gal受体,而肾脏组织中主要分布SAα-2,3 Gal受体,病毒含量检测结果中r MT攻毒组小鼠在脾脏中的含量较r WT攻毒组极显著增加,在肾脏组织中则是显著增加,r MT对在肾脏组织中病毒含量显著增高可能是病毒NA活性降低所导致,说明r MT对SAα-2,6 Gal受体的结合能力增强才是主要变化。研究认为流感病毒HA蛋白第226位氨基酸被认为是决定结合何种流感受体的关键,当226位为L(亮氨酸)易与SAα-2,6 Gal受体特异性结合易攻毒人,当226位为Q(谷氨酰胺)可与SAα-2,3 Gal受体结合攻毒禽类,而猪流感病毒中226位为M(蛋氨酸)可同时攻毒人和禽。研究使用的r WTHA蛋白第226位氨基酸为Q,病毒本身更趋向于结合SAα-2,6 Gal受体,但需要注意HA蛋白第227位和228位氨基酸发生变异能影响该位点的功能,研究使用的r WT未发生上述变异,因而在排除HA蛋白226位点附近位点变异对实验结果造成影响的前提下,NA蛋白第119位氨基酸E到G的突变后会使病毒对SAα-2,6 Gal受体的结合能力明显增强,肯定了HA蛋白Sb抗原区204位氨基酸协同NA蛋白119位氨基酸变异的必要性。

本研究成功突变Pdm/09 H1N1流感病毒A/swine/Guangxi/12/2011株反向遗传学体系p BDNA119E→pBD-NA119G并且成功拯救,为后续流感病毒研究奠定基础。在生物特性研究方面,利用定点突变技术使NA蛋白发生E119G单点突变后,对病毒的复制能力没有明显影响,但用r WT和r MT病毒攻毒BALB/c小鼠后第3天的小鼠肺组织、鼻甲骨、脾和肾的病毒滴度,r MT攻毒组均比r WT攻毒组高,鼻甲组织与肺脏中的病毒滴度相比差异不显著,脾和肾的差异显著。突变株对BALB/c小鼠的致病力有一定增强,临床症状明显;神经氨酸酶活性下降。

利益冲突:无

引用本文格式:程倩,孔子荣,李三木,等.猪源Pdm/09 H1N1甲流NA定点突变拯救毒株的生物特性研究[J].中国人兽共患病学报,2022,38(10):890-897,905.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.129