阿尔茨海默病超微结构研究进展

魏炜 王天雨 孟鑫 张超 李娜 杨志新 任立群

(承德医学院河北省神经损伤与修复重点实验室，河北 承德 067000)

阿尔茨海默病(AD)是发生在中枢神经系统的退行性疾病〔1〕。虽然对AD的研究已取得了较大进展，但对其在认知功能和行为能力方面造成进行性损害的病因尚不明确，且无特效治愈药物，目前的治疗仅可进行对症治疗和延缓AD进展。关于AD的发病机制，目前存在多种假说〔2〕，主要为：①胆碱能功能缺陷假说；②淀粉样假说，β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常沉积；③Tau蛋白过度磷酸化并聚集成神经原纤维缠结(NFT)而引起的Tau蛋白病;④氧化应激和钙调节失衡等。自1932年电子显微镜发明以来，对细胞超微结构的研究进一步深入。AD患者及大鼠的神经元超微结构改变主要为：海马CA1区神经元萎缩，形态不规则；细胞外Aβ聚集形成中心结构均一，外围呈星状的淀粉样蛋白核心，被营养障碍性突起所包围；神经元线粒体肿胀、数目减少，分布不均，嵴排列不规则或断裂变短，基质变浅，线粒体膜模糊、空泡化；内质网应激产生，内质网腔增大、肿胀；含脂滴的次级溶酶体数量增加，脂褐素沉积增多;星形胶质细胞肿大增生呈活化状态。本文拟从AD的超微结构研究方向进行综述。

1 Tau蛋白形成与NFT

Tau 蛋白是一种主要的微管相关蛋白，通过与微管蛋白的结合对微管的稳定和轴浆流动的维持起着重要作用，而过度磷酸化的Tau蛋白可以分解微管，导致微管堵塞，进而导致了NFT的形成，阻碍轴浆流动，诱导神经元变性〔3〕。在已知的17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)家族中，如外显子10(P301L,P301S,N279K)、外显子 9 (G257T,G272V)、外显子12 (V337M)、外显子 13 (R406W)〔4〕,其表达与Tau蛋白的过度磷酸化有关。增强了P301S表达的转基因大鼠，在早期就出现了Tau蛋白过度磷酸化表达，超微结构提示了大鼠轴突纤维丧失和脱髓鞘改变，证实了轴突末端过度磷酸化的Tau蛋白积累与轴突变性、脱髓鞘改变、神经肌肉接处的神经缺失、肌肉萎缩有关〔5〕。关于Tau蛋白的超微结构一直没有得到证实，实验中多采用免疫组织化学染色的方法对其过度磷酸化进行检测，目前研究已经可以通过分辨率3.4～3.5 Å的低温冷冻电镜技术得到展示，其结构为神经原纤维病变中成对的螺旋和直丝(PHF和SF)组成的特征结构和相应的原子模型。该细丝核心由两个相同的原丝组成，包括Tau蛋白的306～378残基，它们采用了β-交叉/β-螺旋结构的结合，形成了Tau聚集的种子模型。而成对的PHF和SF在原丝间排列方式的不同，表明了其超微结构的多态性〔6〕。

2 Aβ沉积

Aβ是由淀粉样前体蛋白 (APP) 经一系列α-/β-/θ-分泌酶切割水解产生的，其中产生的Aβ1～40和 Aβ1～42蛋白更具有神经毒性〔7〕，沉积在大脑皮层和海马区域的细胞外形成老年斑(SP)，能导致神经元的过氧化损伤、Tau 蛋白过度磷酸化、炎症反应损伤、营养障碍性突起、突触损伤甚至神经元凋亡〔8〕，最终导致AD的发生。现在常用的APP/早老素(PS)1转基因小鼠，其原理为转入的人APP基因过表达，产生大量的APP，而PS1的共表达促进了Aβ1-42的产生。Aβ的超微结构为细胞外密集堆积的原纤维和细丝〔9〕，聚集形成中心结构均一，外围呈星状的淀粉样蛋白核心，被营养障碍性突起所包围的典型神经炎性斑块，周围可见退变或即将消失的突触结构和板层解离的髓鞘。Aβ也可沉积于转基因鼠的海马微血管旁及微血管壁，其位置可能在基膜层及基膜层外的神经毡结构中〔10〕。在利用斑马鱼自身启动子appb调控人源APPsw建立的AD转基因斑马鱼模型中也得到证实，6月龄的APPsw 转基因斑马鱼血管上出现Aβ沉积导致血管超微结构变化，而神经元的变化出现在9月龄的转基因斑马鱼上。Aβ对脑微血管的影响早于对神经元的影响，其对AD的作用是相互作用、相互促进的〔11〕。Aβ的产生与其清除之间的不平等是最重要的因素：其清除途径有：(1)自噬体的产生，在AD小鼠模型脑组织中发现，自噬体的产生早于Aβ在小鼠神经元周围的聚集〔12〕。体外细胞学实验证实Aβ无论是由转基因细胞HEK293产生还是外源性加入，均可诱导自噬体的产生和自噬标志物微管相关蛋白(LC)3过表达，在电镜下可观察到具有双层膜的早期自噬体和囊泡状的晚期自噬体。Aβ42相比Aβ40伴随自噬表现出的细胞毒性更强〔13〕。(2)最主要的是通过胶质细胞的胶质蛋白清除，包括：①星形胶质细胞产生低密度脂蛋白受体与Aβ结合使其降解〔14〕；②小胶质细胞吞噬Aβ蛋白，但小胶质细胞激活后产生的炎症反应也会对神经元细胞造成损伤〔15〕。(3)血脑屏障(BBB)转运出脑。脑内及外周Aβ由BBB上的晚期糖基化终产物受体(RAGE)将外周的Aβ转运至大脑，BBB上的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1介导的大脑内Aβ转运通过BBB进入血液〔16〕。

3 线粒体改变

线粒体为突触前神经递质释放提供所需的能量〔17〕。研究表明，与非突触线粒体相比，突触线粒体具有不同的形态和蛋白质组学特征，这可能使突触特别容易变性〔18〕。由于突触是高能量需求的场所，因此必须将线粒体运送到该位置。而Tau蛋白在线粒体顺行转运所需微管的结合和稳定中起着至关重要的作用〔19〕。有研究表明，病理性的Tau蛋白可以干扰此转运过程〔20〕。而线粒体功能障碍和氧化应激已被发现是AD患者和AD动物模型的早期和显著特征〔21〕。在AD的患者和动物模型中，均可见到线粒体的分裂增加、融合减少，超微结构表现为线粒体肿胀变大变圆且数目减少，分布不均，嵴排列不规则或断裂变短，基质变浅，线粒体膜模糊、空泡化〔22〕。在分析了人类两个大脑区域前/后横颞叶皮质(BA41/42)和背外侧前额叶皮质(BA46)的不对称突触的超微结构后，观察到线粒体在突触前末梢中是突触后末梢的两倍至三倍多。超微结构显示了异常的线粒体形态，突触中多囊泡体的存在及AD中斑块附近突触长度的减少。证实了在AD中突触线粒体的区域特定变化，并支持了AD中线粒体向突触前末端的转运或突触线粒体动力学改变的观点〔23〕。在调控融合蛋白线融素(Mfn)2表达消融的大鼠中，电子显微镜显示海马神经元和许多皮层神经元出现线粒体肿胀和嵴结构异常，线粒体的长宽比均接近1，包含许多小的囊性嵴，其外膜呈弥漫性结构，缺乏双膜结构及线粒体膜的破裂甚至外膜几乎不可见。表明成年神经元中的Mfn2消融会引起线粒体破碎和功能障碍，从而通过涉及AD受损的大脑区域中神经炎症的氧化应激反应导致神经变性〔24〕。

针灸作为国粹，其对AD治疗也得到认可。通过针刺AD转基因大鼠的“百会”“涌泉”“大椎”“肾俞”“太溪”等穴位，可明显改善AD转基因大鼠的认知能力，超微结构的观察中可见到线粒体的结构恢复、功能改善〔25〕。针刺6月龄SAMP8小鼠的“百会”“血海”“肾俞”“膈俞”穴，可使其大脑海马神经元线粒体分裂蛋白(Fis)1的表达减少、线粒体融合蛋白(OPA)1的表达增加，有效提高SAMP8小鼠学习记忆能力，减少线粒体动力学异常，超微结构与模型组相比，线粒体形态基本正常，少数嵴腔扩张、嵴溶解〔26〕。

4 内质网改变

内质网是最大的细胞器，具有网状的膜结构，由粗面内质网和滑面内质网组成，粗面内质网与核糖体相关，控制蛋白翻译；滑面内质网包括核膜、细胞质池和小管〔27〕。滑面内质网多沿轴突分布，介导细胞微管骨架和线粒体的正常组织结构〔28〕。管状内质网是滑面内质网的一部分，有证据表明它可能介导囊泡运输和(或)细胞器接触，控制细胞通信，调节线粒体融合和分裂〔29〕。网状蛋白(RTN)是形成管状内质网所必需的〔30〕。在RTN3免疫反应性营养不良神经轴突(RIDNs)的超微结构中，在轴突末端逐渐积累了管状内质网，并且管状内质网异常分布和走向轴突末端出现年龄相关性。在来自AD脑的活检样本中的淀粉样斑块周围发现了这种异常的管状内质网包涵体。在功能上，异常聚集的管状内质网在营养不良性轴突(DNs)形成的早期阶段诱导线粒体裂变增强，并在后期阶段最终导致线粒体变性〔31〕。Aβ沉积引起的内质网应激被认为是AD神经元凋亡的重要机制〔32〕。在透射电镜下 APP/PS1小鼠的大脑皮层神经元内质网腔增大和肿胀，提示APP/PS1小鼠存在内质网应激，而表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的应用对APP/PS1小鼠皮层异常有明显的抑制作用，EGCG还显著降低了APP/PS1小鼠大脑皮层内质网应激标志物GRP78、应激相关的凋亡蛋白CHOP 和Caspase12表达水平〔33〕。

5 突触萎缩

突触由3个要素组成：突触前膜、突触间隙和突触后膜，突触连接不仅是神经元之间的连接，而且是将动作电位从一个神经元传递到另一个神经元的通道〔34〕。突触前膜中突触小泡储存神经递质，线粒体为神经递质的释放提供能量〔35〕。突触损伤与丢失是AD的一个重要特征。突触超微结构变化主要为突触间隙模糊，突触前后膜界限不清，突触后膜致密层减少甚至消失〔36〕，海马区线粒体异常，包括嵴膨大、断裂合并突触数量的减少〔37〕。APP/PS1转基因大鼠的海马GrayⅠ型突触活性长度较野生型大鼠明显缩短，但突触间隙面积、突触界面曲率、突触后致密物厚度无差异〔36〕。该变化也会出现在小脑的浦肯野细胞层。超微结构提示老化的突触前末梢的突触小泡和线粒体数量减少，突触前和突触后膜的特殊区域变薄〔38〕。小脑颗粒细胞的平行纤维与浦肯野细胞的棘突形成兴奋性突触联系(PF-PC)，其突触后致密区(PSD)厚度变薄，突触间隙变宽，突触活性带长度变短及突触界面曲率变小，最终导致突触的传递效能减弱〔39〕。脑源性神经营养因子(BDNF)调控突触活动和突触可塑性〔40〕。突触素是突触小泡特异性标记蛋白，与突触的生长、修复、再生和突触重塑密切相关〔41〕。其在AD模型小鼠的表达均减少〔39〕。而不论基因型或饮食，均未观察到大脑皮层神经元突触数量的差异和线粒体结构、数量的变化〔37〕。

6 胶质细胞作用

6.1小胶质细胞 小胶质细胞是大脑的固有免疫细胞，使用模式识别受体复合物识别并响应sAβ和fAβ〔42〕。下游信号传导诱导肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素(IL)-1β分泌，它们通过趋化作用募集附近的小胶质细胞，并可能引发失控的炎症反应，损伤神经元并引发突触损失小胶质细胞对Aβ清除的作用可以防止Aβ沉淀到纤维斑中，并降低引起神经退行性的有害sAβ的脑内浓度〔43〕。小胶质细胞在超微结构上表现为特征性豆状核，含有密集的异染色质，细胞体中含有大量的线粒体，这些线粒体通常与内质网的典型长片段紧密相连，偶尔伴有高尔基体和吞噬囊泡。APP/PS1小鼠的海马CA1区的小胶质细胞在与fAβ斑块相互作用时结构明显改变，包括突触结构、吞噬体系统的明显变化、显示出内质网应激的增加迹象、脂质包裹体的数量显著增加。在AD人脑的小胶质细胞超微结构中，也发现小胶质细胞接触营养不良的神经突和树突棘，形成了多个接触，几乎完全包围了营养不良性神经突的多个侧面，其中含有一个或多个吞噬包涵体〔44〕。

6.2星形胶质细胞 星形胶质细胞的活化通常被认为是AD中的神经炎症毒性反应。反应性星形胶质细胞可通过吞噬和降解Aβ来限制淀粉样病变〔45〕。而星形胶质细胞的反应性可以通过中间丝蛋白(GFAP)的表达增加及形态上通过其突起的肥大部分在淀粉样蛋白斑块附近被明确识别〔46〕。APP/PS1小鼠海马中Aβ斑块周围的反应性星形胶质细胞广泛均匀地遍及年轻APP/PS1小鼠海马所有区域，不管该区域有没有细胞外淀粉样蛋白沉积。反应性星形胶质细胞在APP/PS1小鼠海马的斑块内和斑块周围表现出具有肥大形态的反应性表型和扩展过程，GFAP表达增强，包裹并吞噬了营养不良性轴突和突触前部分，其星形胶质细胞反应性随年龄及淀粉样蛋白病理改变平行发展。同时还在AD患者的海马中检测到了这些吞噬性星形胶质细胞〔47〕。APP/PS1 转基因小鼠海马区神经元和星形胶质细胞内线粒体固缩，含脂滴的次级溶酶体数量增加;星形胶质细胞肿大增生呈活化状态，并吞噬营养障碍性突触〔48〕。

综上，关于AD的研究已持续百年，随着研究技术的进步，从疾病表现、诊断、治疗的临床层面到发病机制、模型复制、分子生物学、基因学的研究，医务工作者、科研工作者对其研究到达了全新的高度。电子显微镜技术在分子生物学的协作下对超微结构的研究更加细化，因为伦理的关系，对AD的超微结构研究停留在复制的动物模型和患者死后的尸体解剖上，动物模型毕竟不完全等同于人类，死后的代谢改变对研究也有一定干扰，电子显微镜所需组织仅需1 mm3，如能在AD患者的脑组织中进行活检取材，发现新的突触变化或内质网-线粒体连接改变及胶质细胞发挥的双向作用，会有更大研究突破。