肝癌来源的外泌体中miRNA的作用

张娇弟，马梦婷，张 倩 综述，刘欣跃，2△ 审校

兰州大学第二医院：1.药物基因组学实验室；2.检验医学中心，甘肃兰州 730000

外泌体是由多囊体衍生出来的小膜泡，在供体细胞和受体细胞之间穿梭，通过自分泌或旁分泌的方式促进血清和血浆中细胞间通讯的新模式，其作为细胞间传递信号的囊泡结构，在肿瘤增殖、侵袭和耐药中发挥重要作用。肿瘤来源的外泌体中含有诸如核酸、脂类和蛋白质等生物分子，是肿瘤生物标志物和治疗载体的潜在来源，其含有的多种RNAs已逐渐被认为是新的生物标志物、病理生理介质、预后指标，甚至是疾病治疗的纳米药物。肝细胞癌(HCC)是全球第六大最常见的癌症，也是全球癌症死亡的第四大原因[1],虽然肝癌的治疗方法多种多样，但肝癌的预后仍然较差，诊断延迟以及高转移率、复发率是导致肝癌预后不良的主要原因[2]，因此早诊断早治疗对改善肝癌患者预后极其重要。然而目前还没有有效的生物标志物和技术，因此，探索与HCC相关的分子机制，开发新的HCC临床预防生物标志物是迫切需要的。现已发现肿瘤微环境在肝癌的发生、发展中起着至关重要的作用。肝癌肿瘤微环境主要由成纤维细胞、免疫细胞和细胞外基质组成，异常的肿瘤微环境与肝癌转移密切相关。最近的研究表明，HCC中多种信号通路和细胞间通讯失调,而外泌体是细胞间通讯的主要媒介之一，其由多泡体衍生出来的小膜泡与质膜融合后由各种细胞类型分泌而成。外泌体携带许多具有多种生物学功能的物质，包括miRNAs，与肿瘤的发生、进展和恶性肿瘤的转移密切相关[3]。miRNAs是一种内源性非编码小RNAs，主要存在于真核生物中，研究发现miRNAs在肿瘤发生、转移和耐药中发挥着重要作用。在HCC中，miRNAs不仅是一种有效的生物标志物,还具有调节肝癌细胞增殖、凋亡和化疗药物敏感性的作用，并能通过调控相关靶基因抑制肿瘤的发生和进展[4]。因此进一步了解HCC来源的外泌体中miRNAs对HCC的及时诊断和治疗具有重要意义。本文旨在综述肝癌来源的外泌体中miRNAs在肝癌中的一些潜在调控机制及诊断价值，以期为肝癌的早期诊断和精准治疗提供新的思路。

1 肝癌中miRNAs的表达

miRNAs有18～25个核苷酸,通过抑制靶mRNAs的翻译有效地调控基因表达[5]。研究发现 miRNAs可能具有肿瘤抑制或致癌作用，许多研究已经报道miRNAs在包括HCC在内的不同肿瘤中异常表达[6]。在肝癌中，miRNAs可下调或缺失，包括miRNA-26a、miRNA-29c、miRNA-21[7]及miR-424-5p[8]等；相反,致癌性miRNAs包括miR-10b-5p、miR-18a-5p、miR-215-5p、miR-940[9]、miR-122、miR-148a、miR-1246[10]、miR-1251-5p[11]、miR-378b[12]等在肝癌中过度表达。因此肝癌中miRNAs异常表达可作为其诊断、转移及预后的有效生物标志物。

2 肝癌来源的外泌体中miRNAs的作用

2.1参与肝癌转移 转移是HCC患者疾病死亡的主要原因。然而，肝癌转移的机制尚不清楚。研究发现肝癌来源的外泌体miRNAs可通过诱导肿瘤血管生成、免疫逃逸、细胞外基质重塑、耐药等介导肝癌转移。

2.1.1血管生成 血管生成是肿瘤生长和转移的重要过程，肝癌来源的外泌体首先通过调节和破坏其靶点的组织结构，导致肿瘤血管生成，从而促进肝癌转移[13]。ZHOU等[14]的研究显示，外泌体miRNA-21可直接靶向磷酸酯酶(PTEN)，导致造血干细胞中丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1(PDK1)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的激活，并且miR-21高表达与癌相关成纤维细胞(CAFs)活化程度高、血管密度高相关，活化的CAFs通过分泌血管生成细胞因子，进一步促进了肿瘤的进展；此外，转化生长因子-β受体Ⅲ(TGFβRⅢ)是一种普遍表达的TGF-β共受体，是TGF-β信号转导和肿瘤进展的调节剂，包括肝癌的转移和侵袭。CHEN等[12]发现HCC中miR-378b表达上调，TGFβRⅢ表达下调，miR-378b靶向TGFβRⅢ,miR-378b过表达可促进血管生成和肿瘤生长，耗尽miR-378b可干扰肝癌细胞迁移并促进细胞凋亡，并且下调TGFβRⅢ可逆转miR-378b下调对HCC细胞的影响，因此miR-378b促进肝癌细胞进展和血管生成，原因可能与TGFβRⅢ相关，可为肝癌的治疗提供药物靶点；相反，外泌体miR-451a作为一种抑癌因子，有研究发现其可诱导HCC细胞系和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的凋亡，LPIN1是miR-451a的一个关键靶点，通过调控肝癌细胞凋亡和血管生成抑制HCC的发生[11]。

2.1.2免疫逃逸 肿瘤来源的外泌体可能具有免疫调节特性，影响T细胞功能和肿瘤逃脱免疫监视，诱导免疫耐受，促进肿瘤进展[15]。内质网(ER)应激在肿瘤进展和调节免疫细胞功能中发挥重要作用。有报道称，肝癌中ER应激标志物水平与巨噬细胞浸润和PD-L1表达相关,ER应激导致HCC细胞释放富含miR-23a-3p的外泌体靶向巨噬细胞，miR-23a-3p一旦被巨噬细胞内化，可抑制PTEN的表达，激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT通路，上调PD-L1，进一步研究证实外泌体激活的巨噬细胞与T细胞共孵育可下调CD8+T细胞比例，抑制白细胞介素(IL)-2的产生，并诱导T细胞凋亡[16]。将富含miR-146a-5p的外泌体从HCC细胞(小鼠和人)转移到巨噬细胞中也获得了类似的结果[17]。因此HCC可能通过高表达PD-L1抑制CD8+T细胞的细胞毒性，介导免疫逃逸。NK细胞是人类肝脏免疫系统的另一个主要组成部分，肝癌细胞如Hep-3B，可以释放富含miR-92b的外泌体，通过限制CD69抑制NK细胞的作用[18]。NAKANO等[18]分别提取原位肝癌模型大鼠血清和无外泌体血清，静脉注射裸鼠，前者血清在致瘤组织中显示高水平的AFP和过表达的miR-92b，而后者未显示ATP水平异常，ROC曲线证实，患者血清miR-92b水平对HCC早期(AUC=0.925)和晚期(AUC=0.761)复发具有理想的可预测性。从机制上讲，血清CD69作为活化T细胞的表面抗原之一，不仅参与淋巴细胞增殖诱导和信号转导，而且作为重要的介质参与NK细胞介导的细胞毒性，HCC来源的外泌体中过表达的miR-92b在肿瘤微环境中浸润NK细胞，参与抑制CD69表达，拮抗NK细胞对HCC的细胞毒作用，从而诱导肿瘤细胞免疫逃逸。

2.1.3细胞外基质重塑 细胞外基质的主要成分包括胶原蛋白、纤维连接蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖，它们与肿瘤细胞和基质细胞的表型和功能改变有关[19]。外泌体通过介导细胞外基质重塑改变肿瘤微环境，最终促进肿瘤转移。研究发现来自高转移性HCC的外泌体富含癌蛋白和RNAs，外泌体被正常肝细胞摄取后，激活PI3K/AKT和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路，诱导活性基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌，促进细胞外基质降解，加速肿瘤细胞迁移和侵袭[20]；上皮-间质转化(EMT)参与上皮细胞极性丧失、细胞外基质重塑和转移前龛的形成，增强癌细胞进入循环系统的能力，促进肿瘤细胞转移，有研究发现外泌体中含有的致癌miRNAs参与了EMT的调控[21]。然而，外泌体是否促进肝癌细胞EMT的发生及其机制尚不清楚。有研究发现在EMT过程中，上皮肿瘤细胞在肿瘤基质中CAFs的影响下获得间充质特征，肿瘤细胞失去极性和细胞间连接，进入低增殖状态，迁移和侵袭能力增强[22]；CAFs作为肿瘤微环境中最多产的细胞类型，是转化成纤维细胞的一个子集，促进肿瘤进展和转移，ZHANG等[23]从HCC肿瘤组织中提取CAFs和癌旁成纤维细胞(PAFs)进行培养并分离出外泌体，分析发现，与PAFs相比，CAFs来源的外泌体miR-320a水平更低，miR-320a可以直接靶向前B细胞白血病同源盒3，抑制MAPK信号通路的激活，从而抑制转移，这表明miR-320a水平的降低可能促进肝癌的转移。最近的一项研究表明，高转移性肝癌比低转移性肝癌更易将正常成纤维细胞转化为CAFs[24]，因为HCC合并肺转移患者血清外泌体miR-1247-3p水平明显高于无肺转移患者，外泌体miR-1247-3p直接靶向β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ(B4GALT3)，导致成纤维细胞中β1-整合素/NF-κB信号通路激活,从而将成纤维细胞转化为CAFs，活化的CAFs通过分泌IL-6、IL-8和促炎细胞因子促进肝癌细胞的转移，增强肝癌细胞的干细胞特性和EMT。这些数据提示，HCC细胞来源的外泌体miR-1247-3p可促进炎症微环境和肺转移。

2.1.4肝癌耐药 肿瘤细胞耐药使药物疗效降低，导致患者预后不良。近年来，越来越多的研究表明肿瘤来源的外泌体可以通过多种机制促进耐药。外泌体可将耐药相关蛋白和miRNAs运输到靶细胞，实现耐药细胞与敏感细胞、基质细胞与肿瘤细胞之间的信号传递，诱导肿瘤细胞耐药[25]。ZHANG等[4]的研究发现外泌体miR-199a-3p表达水平与HCC中顺铂(DDP)耐药相关，上调miR-199a-3p可逆转肿瘤的化疗耐药性，减缓了肿瘤在体内的生长。同样LOU等[26]证明miR-199a-3p水平增高与HCC阿霉素(Dox)化疗敏感性呈正相关，miR-199a-3p具有调节潜在靶标、结合细胞、抑制细胞入侵、刺激细胞凋亡和减弱细胞功能的能力，其在肝癌耐药细胞中内化可通过抑制mTOR通路介导药物高敏感性,DDP或Dox化疗后显著抑制肿瘤细胞增殖和转移，并伴有细胞凋亡率升高。此外越来越多的证据表明外泌体miRNAs参与了索拉非尼耐药机制。miR-32-5p在肝癌耐药组织中过表达，耐药癌症组织释放的外泌体将miR-32-5p转移到索拉非尼敏感的HCC细胞中，通过抑制紧张素同源物PTEN激活PI3K/AKT通路，从而促进血管生成和EMT，介导肝癌的多药耐药[27];在HIRAO等[28]的研究中发现，miR-125-5p诱导肝癌细胞(PLC/PRF5)索拉非尼耐药，并且PLC/PRF5-miR-125-5p显示出更高的迁移和侵袭能力，进一步研究发现，miR-125-5p抑制 ataxin-1，从而诱导EMT和肿瘤干细胞特性。miR-744在索拉非尼耐药HepG2细胞来源的外泌体中表达降低,当使用miR-744过表达的外泌体处理时，HepG2细胞的增殖显著受到抑制，索拉非尼耐药性降低[29]。因此，miR-744在HCC的增殖和化疗耐药性中具有重要作用，血清外泌体miR-744可能作为HCC的生物标志物，可为HCC治疗提供创新策略。以上表明，miRNAs的表达状态将成为HCC患者治疗选择有效药物的标志物。

2.2作为肝癌早期诊断的生物标志物 早期发现HCC对于治疗和改善其预后至关重要，然而早期发现HCC具有挑战性，因为该病通常无症状进展。超声虽为肝癌监测的首选方法，但存在诊断准确性低等局限。甲胎蛋白(AFP)为肝癌最常用的血清学检测，但对早期HCC诊断的敏感性较低[30]。超声与AFP联合使用虽然可以提高检出率，但可能增加假阳性和成本，其他肿瘤生物标志物，如凝集素结合的AFP、磷脂酰肌醇聚糖3、高尔基体蛋白73等，也不能有效提高诊断的准确性[15]。因此，寻找HCC早期检测的敏感、特异的生物标志物极其重要。液体活检是一种无创的癌症诊断方法，近年来受到广泛关注，循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA是最常用的液体活检方法，外泌体miRNAs也被认为是液体活检标本[31]。SOROP等[30]的研究表明，HCC患者来源的外泌体中miR-21-5p上调，miR-92a-3p下调，基于AFP诊断HCC的AUC为0.72，将AFP、外泌体miR-21-5p、miR-92a-3p 纳入HCC诊断的Logistic回归方程后，其AUC为0.85，显著优于AFP，因此外泌体miR-21-5p和miR-92a-3p可与AFP一起作为筛查HCC的潜在生物标志物。ZHANG等[32]的研究显示3种血清miRNAs (miR-92-3p、miR-107和miR-3126-5p)联合AFP可以很好地将早期HCC患者和AFP低水平HCC患者与对照组区分开来。另外有研究显示HCC来源外泌体中miR-122、miR-148a和miR-1246的表达水平明显高于肝硬化组和正常对照组，但与慢性肝炎组无明显差异，miR-148a对早期HCC和肝硬化的鉴别效果较好(AUC=0.891)，明显优于AFP(AUC=0.712)，且miR-122、miR-148a和AFP联合使用可进一步提高AUC至0.931，miR-122是区分HCC和正常对照组的理想选择(AUC=0.990)[10]。这些数据表明，肝癌来源的外泌体miRNAs与传统生物标志物的结合可能进一步提升其诊断的准确性。最近的一项研究综合分析3种不同的人肝癌RNA测序数据集miRNAs表达谱，发现血清外泌体miR-4661-5p在HCC所有分期(AUC=0.917)，甚至早期(AUC=0.923)均具有良好的诊断性能，其准确性高于其他候选血清外泌体miRNAs和血清AFP，此外，由外泌体miR-4661-5p和miR-4746-5p组成的外泌体miRNAs面板被认为是早期诊断HCC最准确的生物标志物(AUC=0.947)[33]。因此血清中多种外泌体miRNAs的存在为外泌体液体活检技术在HCC早期诊断中的临床应用开辟了广阔的前景。

3 小 结

外泌体作为小型外囊泡，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，了解外泌体的生理功能对于阐明它们如何影响癌症进展至关重要。外泌体通过物质运输介导细胞间信号转导，诱导不同受体细胞的生理或病理生理过程。外泌体miRNAs 参与调控肝癌细胞与肿瘤微环境之间复杂的相互作用，并通过特定的方法如肿瘤血管生成、细胞外基质重塑、EMT、耐药和免疫逃逸等介导肝癌的发展。因此，外泌体miRNAs作为肝癌诊断和预后的生物标志物或为未来HCC抗肿瘤策略的靶点提供了一个新的潜在角度，对其特异调控机制的相关研究可为肝癌的精准治疗提供潜在靶点。同时，基于外泌体miRNAs的液体活检技术也为多发性恶性肿瘤的早期诊断和预后评估提供了一种无创、有前景的选择。尽管外泌体miRNAs具有许多优点，但在临床应用中仍面临一些关键问题，如分离和纯化方法有局限性，如费时、费力，缺乏大规模的前瞻性研究，无法提供液体活检可以替代肿瘤组织活检的证据，产生外泌体miRNAs的细胞类型不同等，这在临床上必须加以控制。因此，需要进行更多的研究来解决这些问题，并开发出更有效的外泌体miRNAs应用于临床。