植物种质资源保存研究进展

江笑丹 蒋真盛

(国家知识产权局专利局专利审查协作江苏中心，江苏 苏州 215163)

亲代传给子代的遗传物质叫作种质(germplasm)，具有种质并能繁殖的生物体叫作种质资源(germplasmresource)[1]。种质资源是物种进化、遗传学研究及植物育种的物质基础。

种质资源保存的方式有2种：原生境保存和非原生境保存，原生境保存是在原始生态条件下保存，可以保持高水平的遗传完整性；非原生境保存是种质保存于该植物原生态生长地意外的地方，通过采集种子和植株部分在人工控制条件下保存种质。种质资源保存的方法包括种植保存(就地保存、迁地保存)、贮藏保存(又称种子保存，包括短、中、长期库)、离体保存(保存的材料种类多样，有愈伤组织、悬浮细胞、幼芽生长点、花粉、花药、体细胞、原生质体、幼胚、组织块等)、基因文库保存(通过重组DNA技术将植物DNA插入质粒，转染到宿主细胞进行扩增)、利用保存(育成品种或育种中间材料)等[2，3]。

本文主要围绕最常见、有效，操作简便，又便于种质资源运输和交流的种子保存和离体试管保存2种方法展开。旨在为今后种质资源的进一步研究和应用提供基础。

1 种子的保存方式

1.1 种子低温保存

种子被誉为农业的“芯片”，种业是保障粮食安全的源头。种子的保存方式一般有常温和低温2种，低温保存不同的温度所对应的保存时间也不同，如，4℃的中期库种子寿命一般为5～10a，-18℃的长期库种子寿命可达到20a以上。然而，上述方法仍然无法做到永久保存，20a后需要对种子库进行更新。为了进一步延长保存时间，人们考虑进一步降低保存温度，采用液氮保存植物种子。申请人为长沙湘资生物科技有限公司的公开专利CN107691432A公开了一种白花蛇舌草种子的超低温保存方法，首先用培养液培育，随后转入冻存管，加入抗冻液，采用梯度降温以-1℃·min-1的速率降至指定温度后投入液氮罐。所述培养液和抗冻液组分类似，均由MS培养液(最初为烟草细胞培养设计，含丰富的无机盐、氨基酸和维生素)和DMSO、甘油等冻存保护剂组成。上述冻存程序和保存液组成适用于多种不同科属的植物种子，如鸡血藤(豆科)、桔梗(桔梗科)、千金子(禾本科)、羌活(伞形科)、天南星(天南星科)、川贝母(百合科)、白及(兰科)、马比木(茶茱萸科)、光皮树(山茱萸科)、黄精(百合科)、白蔹(葡萄科)、威灵仙(毛茛科)、七叶一枝花(百合科)、山苍子(樟科)等。

近年来，科研人员致力于对保存液配方的调整，以期提高种子解冻后的发芽率。申请人为中禾生物种业集团有限公司的公开专利CN109892323A公开了一种玉米种子超低温保存方法。该方法先采用PEG4000和甘油混合液对种子进行预处理，随后置于羟丙甲纤维素(HPMC)和氯化钠的混合溶液中进行冻存。HPMC分子量86000，属于高聚物。采用含高聚物的保存液保存植物种质是本领域的常规手段。高聚物、低聚物和小分子化合物作为冷冻保护剂时起到的作用不同。小分子化合物易与水分子通过氢键结合，穿透细胞膜进入细胞内部，从而降低冰点。低聚物能够诱导质壁分离，在细胞壁和细胞膜之间形成缓冲层，减轻冰晶生长对原生质体的机械压力。高聚物虽然不能进入细胞内部，但是能够结合水分子，降低细胞外自由水的含量，减少胞外冰晶的形成，从而起到冷冻保护的作用。结合上述冻存保护剂的保护机制，科研人员在确定保存液配方时，通常会将几种不同类型的保护剂混合使用，从而起到多层次保护的目的。

对于种子低温保存而言，保存液组分影响保存效果，如保存期限、种子萌发率等;降温程序也与种子能否恢复活力息息相关。申请人为中国医学科学院药用植物研究所海南分所的公开专利CN108684657A公开了一种降香种子超低温保存方法。降香为常用的中药品种，具有化瘀止血、理气止痛的作用。基源为豆科植物降香檀树干和根的干燥芯材。主要分布于海南白沙、东方、乐东、三亚等地，属于顽拗性种子。降香因木材珍贵，成年植株几乎被砍伐殆尽，近年来有些树桩都被连根拔起，供作药用或工艺美术用。因此，降香已是濒危物种，亟需开发合理的资源保护方法。上述专利中采用如下梯度降温的方法：先在室温下用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂，分别以5～8℃、0～-2℃、-5～-8℃3个温度节点进行降温，最后投入液氮保存。冻存前种子的含水量为12.5%～13.5%。上述方法解决了现有技术中部分降香种子经超低温保存后芽不能健康成苗的问题。

1.2 顽拗性种子

然而，并不是所有种子均适合超低温保存。1973年，Roberts根据种子的贮藏行为，把种子分为正常性种子和顽拗性种子2类。顽拗性种子主要存在于2类植物中，水生草本植物，如菱、茭白等；具有大粒种子的多年生木本植物，如椰子、芒果、荔枝等热带植物以及板栗等温热带植物。由于顽拗性种子的不耐脱水性，成熟脱落时代谢相对活跃，脱离母体后的生长状态不断变化，因此种子采收后要采用严格的保存机制来维持其活力。短期的贮存方法有吸涨贮藏或水浸贮藏、部分脱水室温贮藏、气调法等。对于小粒的顽拗性种子，通常能够实现液氮下的超低温贮藏，因为该类种子容易实现快速脱水的过程；而对于大粒的顽拗性种子，通常不适合在-196℃下保存，因为该类种子不易实现快速脱水，而缓慢脱水和降温对种子是致命的[4]。申请人为肇庆学院的公开专利CN109362716A公开了一种柑橘砧木种子复合型保藏剂，所述柑橘砧木种子即为顽拗性种子。上述发明采用钾盐型高分子吸水树脂与海藻酸钠、杀菌剂相结合作为保藏剂，实现了柑橘砧木种子在3～5℃低温条件下的全年储藏，并保证了种子的高萌发率。上述发明中吸水树脂能够使得种子处在相对干燥的外环境中，结合杀菌剂的使用，使种子不易发霉变质。但是种子的含水量仍然处在较高的水平，若进行0℃以下的冷冻，仍然会因为冰晶损伤导致种子失活无法萌发。因此，申请人选择在3～5℃的低温环境下储藏。上述保藏剂的选择为顽拗性种子的低温保存提供了一种新的思路。此外，海藻酸钠的选择是申请人从人工种子的制备方法中获得的启示。1978年英国科学家Murashige首次提出人工种子的概念，人工种子生产不受季节限制，易保存和运输，可保持优良性状，拯救珍稀和药用物种，因此一直是研究热点。在人工种子的生产过程中，羧甲基纤维素等凝胶剂以及壳聚糖等抑菌剂被用作人工种皮。人工种子的贮藏方法包括低温抑制法、液体石蜡法、干燥法等[5]。可见，在今后开发顽拗性种子保存方法的过程中，借鉴人工种子的保存技术，如包埋技术，不失为一种有效的选择。

1.3 其他种子

除了顽拗型种子外，海草由于其生长环境的特殊性，种子的保存液也与一般植物不同。申请人为中国科学院海洋研究所的公开专利CN107593687A公开了一种川蔓草种子保存的方法。通过将川蔓草种子果皮腐烂后洗净，浸泡在灭菌高盐人工海水中，于0℃低温避光保存。川蔓草具有重要的生态价值，是越冬食草候鸟和底栖无脊椎动物的重要食物资源，并且能够改变河口海岸带栖息地的水质质量。然而，川蔓草幼苗由于无法抵御夏季的干燥和冬季的寒冷，成苗率很低。而上述专利中的保存方法解决了川蔓草种子的长期保存问题，为川蔓草资源保护工作提供了技术支持。从顽拗性种子和海草的保存液设计过程中可以看出，结合植物的自然生长环境以及种子对恶劣环境的耐受能力是选择保存液组分的重要原则。

2 花粉的保存

花粉包含有其物种的所有基因类型，具有丰富的遗传多样性，是种质保存和交换的重要材料。但是一般情况下，花粉寿命很短，这给授粉带来了极大困难。采用低温或超低温保存的方法能够大大延长花粉的保存时间，避免病虫害的引入，为种质交换提供方便。花粉与种子类似，对冻存前的含水量有一定的要求，如，银杏花粉的含水量低于12.7%时，冻存于液氮中仍能存活，花粉含水量高于20%时，萌发率与生活力均显著下降。但是也有对水量要求不高的植物，如芍药、梅花多个品种的花粉超低温保存时无需任何脱水处理[6]。申请人为广东省农业科学院蔬菜研究所的公开专利CN110249800A公开了一种苦瓜花粉的收集和保存方法。其发明点在于，收集开花前1d的花蕾，人工干燥使花药开裂，过筛除杂后在4℃或-80℃条件下保存。上述方法保存的花粉相比于开花后收集的花粉萌发率显著提高。申请人为山东省农业科学院蔬菜花卉研究所的公开专利CN108651444A公开了一种蝴蝶兰花粉保存及育种方法，根据花粉的使用需求，不同的保存期限对应不同的保存温度，1～7d内使用的在18～25℃下暂存，8～60d内使用的放置在4℃的冰箱内保存，60d后使用的保存在-20℃的冷冻室内。蝴蝶兰为观赏花卉，为了繁育出更多外形性状的品种，需要进行杂交处理。上述专利克服了现有技术中蝴蝶兰杂交工作效率不高、杂交后需要去除母本花粉团造成花粉浪费、对于部分花期不遇的品种无法进行杂交等缺点。上述专利中，主要目的是起到对花粉的转移作用，所保存的花粉多在当年当季使用，因此，仅采用室温保存和常规低温保存。

一些植物的花粉并不适合采用常规的低温保存方法。例如，罗汉果花粉寿命自然条件下仅1～2d，家用冰箱贮藏也不超过5d。现有技术中，罗汉果生产上一般100株雌株配置3～5株雄株，由于气候变化等影响，有时会遇到雌、雄株不同时开花或雄株开花量不满足授粉需求的问题。因此，需要有雄株花粉储备才能满足生产需要。申请人为桂林吉福思罗汉果有限公司的公开专利CN109362718A公开了一种罗汉果花粉超低温贮藏的方法，将罗汉果花粉常温下用硅胶或无水氯化钙干燥24～72h，直至花粉含水量为10%～40%，装入冻存管密封后，转入-86℃超低温冰箱或-196℃液氮中贮藏。上述方法克服了罗汉果花粉短缺以及常规方法贮存期限短的问题，噻唑蓝染色显示，超低温保存的花粉解冻后人工授粉的结实率显著高于家用冰箱(-18～20℃)保存的花粉。

3 植物茎尖和芽的保存

植物茎尖和芽的保存通常需要预培养，如果只使用冻存保护剂，不能保证细胞或组织具有较高的存活率，许多茎尖分生组织即便使用冻存保护剂，细胞或组织也不能存活。预培养的目的是增加细胞分裂与分化的同步化,减少细胞内自由水的含量,使细胞能经受低温胁迫。如，在B5培养基中附加5%DMSO、5%葡萄糖，在4℃预培养2d，可提高白花三叶草茎尖分生组织的存活率。此外，低温锻炼也是保证冻存效果的有效方法，可激活植物体内的抗寒机制。如，经-30～-50℃低温训练的苹果枝条，其叶芽在液氮中保存2a仍可存活[7]。预培养和低温锻炼均可视作正式冷冻条件的预适应，即相比于正式冷冻条件更为温和的脱水条件和温度。茎尖处理的降温方法有慢冻法、快冻法、玻璃化法、包裹/脱水法、包裹/玻璃化法等多种，上述方法各有利弊，需要研究人员结合实际的设备条件、冻存材料的数量、冻存保护剂的毒性作用等因素进行针对性地选择。中国农业科学院作物科学研究所的专利CN109221094A公开了一种香蕉离体茎尖超低温保存方法。将香蕉苗置于蔗糖培养基中预培养2d，随后剥取茎尖，经装载液装载后，利用玻璃化溶液PVS2于0℃下处理50min(相当于低温训练)，在液氮中蘸一下后迅速装入盛满液氮的冷冻管，浸入液氮保存。所述方法克服了现有技术采用田间保存结合离体试管苗保存，人力、物力、财力耗费大的缺陷。

4 新动态

目前，种质资源保存方法主要着眼于新机制方面的研究、精细化保存等方法。如，申请人为上海交通大学的专利CN109619094A公开了一种百子莲SK3脱水素蛋白在降低细胞胁迫伤害及改善超低温保存效果中的应用。上述方法跳出了传统的超低温保存手段从减少冰晶生成的角度进行改进的思路，转而以种质资源超低温保存过程中可能遭遇的ROS氧化胁迫为切入点，寻找具有更优保护效果的抗氧化剂。解决了现有技术中种质资源超低温保存后生长率恢复不佳的问题。沈阳药科大学的专利CN114128437A、CN114128438A中公开适合苦参、石柱参的保存方法，从中可以得出只有对具体种子种质资源的条件进行优化研究，建立良种种源基地，才能提高具体种质资源的质量。种质资源精细化保存是建立良种种质资源库的关键。另外，对于离体资源的保存，笔者认为可以从低温保护剂出发，将领域内新低温保护剂如纳米碳点、微米颗粒、液体金属等用于保存种质资源，以期提高复苏率。

5 总结与期望

本文主要种子、花粉、茎尖、芽等不同类型的种质资源的保存方法进行归纳。普通种子和顽拗性种子均可采用投入液氮的方式保存，区别在于，冻存前的干燥过程普通种子能够干燥至较低的含水量，而顽拗性种子由于不耐干燥，冻存前的含水量较高，如何避免冰晶对种子的损伤是需要主要考虑的问题。因此，对于降温程序的调节(如快速冷冻)以及冻存保护剂的选择显得尤为重要。花粉作为种质资源冻存时不必准备冻存保护液，只需干燥后冷冻即可，操作简便，且体积小便于跨区域种质资源的运输与交流。茎尖和芽相对而言生理状态更为脆弱，通常需要预培养和低温锻炼才能够获得理想的保存效果。

习总书记强调，只有用自己的手攥紧中国种子，才能端稳中国饭碗，才能实现粮食安全。我们应该加大对种子自主知识产权的保护，加大自主创新。尽管现有技术已经提供了丰富的种质资源保存方法，然而，目前针对濒危、珍稀植物的保存仍然是逐一尝试，效率较低。未来可以共建共享平台，在共享库中录入植物共性数据，经过大数据分析，生成优选的保存方案，实现高效保存。另外，需尽快完善种质质量评估体系和相关技术标准，合理布局，构建良种种质资源库。