基因编辑猪用于急性肝衰竭治疗的路径探讨

淮国丽， 杜嘉祥， 潘登科

1 电子科技大学附属医院， 四川省医学科学院·四川省人民医院， 临床免疫转化医学四川省重点实验室， 成都 610072；2 成都中科奥格生物科技有限公司， 成都 610094

对于肝细胞癌或急性肝病等终末期肝病患者，肝移植是唯一的治疗方式，但是供体的极度短缺严重影响了等待移植者生命的延续。近五年来，我国器官捐献率有所上升，但是供肝和移植需求的比例仍严重失衡。2020年，我国共有17 897例患者接受移植，但是仅占等待移植患者的5%左右，这意味着有近95%的患者可能因为等待期间病情恶化等因素错过移植机会或者被移出等待名单[1-2]。利用猪来源的供体肝和肝细胞被认为是潜在的解决器官紧缺问题的有效方案。1968年，Calne 等[3]首次尝试野生型猪-非人灵长类动物的异种肝移植实验，术后6～30 h内，7只狒狒中有4只死于大量出血，考虑其主要的死亡原因是超急性排斥反应(hyperacute rejection，HAR)。α-1,3-半乳糖苷转移酶(α-1,3-galactosy transferase，GGTA1)的敲除(GTKO)使HAR问题基本被解决，但是移植物仍无法长期存活[4]。目前，研究者认为影响异种肝移植存活率的主要原因包括：移植物血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)，持续性血小板减少症和全身性消耗性凝血功能障碍，且伴随的体液和细胞介导的免疫排斥反应影响细胞肝移植物的长期生存[5]。此外，由于肝脏是一个具备合成功能的特殊器官，供体与受体的不相容性也会影响移植物的存活，因此，探索适用于异种肝移植的人源化肝脏也是解决异种肝移植问题的一个思路。根据影响异种肝移植术后影响移植物存活的因素，本文将从基因编辑猪和嵌合体2个角度进行综述，并展望基因编辑猪和嵌合体猪在未来异种肝移植的临床应用。

1 应对固有免疫的基因改造

1.1 HAR 从1968年Calne 等实施第1例野生型(WT)猪到非人灵长类动物的异种肝移植后的20年内，一些研究团队完成了几十例WT猪到非人灵长类动物的异种肝移植实验。然而，受体的存活时间从未超过3 d，移植后均发生HAR，并且发现受体内出现内皮细胞损伤以及IgM、IgG和C3的沉积，受体的血管有血栓形成和出血性坏死等现象，由此推断野生型猪作为供体很可能会造成移植失败[3,6-8]。在2000年，Ramirez等[9]实施了第1例以表达衰减加速因子(CD55)的转基因猪为供体，对狒狒进行原位异种肝移植，狒狒存活8 d并且肝移植物未表现出HAR的病理学特征，提示CD55可显著限制补体活化并有效控制HAR强度。2005年，该团队在供体猪内又转入人补体调节蛋白-MAC抑制蛋白(CD59)和α-1,2-岩藻糖转移酶(H-transferase)，将CD55/CD59/H-transferase供体肝移植至狒狒体内后，发现供肝未出现明显的HAR且肝脏结构完整，但存活时间仅延长了13～24 h。以上基因编辑猪虽然对HAR有所改善，但并未实现延长移植物的存活时间[10]。随后，大量研究发现供体猪的特异性抗原包括α-Gal才是导致HAR的主要因素。2010年，Esker等[11]首次使用α-Gal敲除(GTKO)且表达人膜辅因子蛋白(CD46)的小型猪作为供体开展异种肝移植，受体术后虽然出现了严重的血小板减少症，但肝功能正常，且生存时间延长至7 d。

以上敲除GGTA1可有效改善HAR的发生，移植物的生存时间仍未明显改善，有研究团队尝试获得包括α-Gal抗原以内的抗原双敲或者三敲猪来作为供体来改善猪和人的不相容性。Butler等[12]通过体外检测发现胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)联合GGTA1敲除即GGTA1-/-CMAH-/-猪肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)比GGTA1-/-与人血小板结合更少，提示抗原双敲除比单敲除更能抑制体液免疫反应。此外， Cimeno等[13]利用体外灌注模型研究发现基因型为GTKO/hCD46/Neu5GcKO的猪肝，相较于GTKO/hCD46基因型而言，白蛋白表达水平更高，提示Neu5GcKO表型可降低抗原特异性，对移植物具有保护作用。尽管如此，有学者[14]认为GTKO和CMAHKO 双敲猪仍不足以实现延长移植物的存活率。此后，Li等[15]利用CRISPE/CAS9技术敲除了永生化猪内皮细胞中4个主要异种抗原GTKO、CMAH、β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(B4GALNT)和SLA-Ⅰ，在体外观察人对抗原敲除猪的特异性反应，结果显示，这4个抗原的敲除可以显著降低猪细胞的抗原性，但是仍能激活人的自然杀伤细胞反应。

综上所述，通过基因编辑技术对供体猪GGTA1、CMAH、β4galNT2和SLA-Ⅰ进行抗原双敲除乃至多敲除可以降低异种肝移植的异种特异性反应，但若联合人体调节补体蛋白的转入包括CD46，CD55和CD59，异种肝移植术后排斥反应等引起的肝移植物损失可能会大有改善。但异种肝移植后的血小板减少症等问题还需要通过其他相关基因的编辑来缓解，由此才能更进一步实现延长移植物生存时间的期望。

1.2 血小板减少症 目前，猪到非人灵长类动物的异种肝移植试验结果表明，异种肝移植术后的受体会很快出现移植物TMA，持续性血小板减少症和全身性耗竭性凝血功能障碍，而这些问题也是影响异种肝移植存活时间的主要原因。所以，针对固有免疫细胞介导的血小板吞噬作用以及凝血相关蛋白激活的凝血级联反应等问题，可以利用基因编辑技术对供体猪进行改造，来改善异种肝移植术后移植物丢失问题[1]。

在猪-非人灵长类动物的异种肝移植中，非人灵长类动物血小板会被猪肝移植物识别为“外来物”，并被猪 Kupffer细胞和LSEC吞噬[16]。CD47是一种在所有组织中普遍表达的Ig超家族的整合素相关蛋白，其与巨噬细胞和中性粒细胞表达的信号调节蛋白α结合，将Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶1募集到磷酸化的免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序，印上能够调节自我吞噬的抑制信号(“不要吃我信号”)，该信号可减少巨噬细胞介导的调理细胞吞噬作用[17]。潘登科团队[18]成功制备GTKO/hCD47巴马小型猪，并验证了hCD47的转入可以减弱异种移植中由受体巨噬细胞引起的排斥反应。Zhang等[19]将GTKO/hCD7猪的肝脏移植到藏酋猴中，发现异位辅助移植后受者血流量稳定，受体没有出现严重的凝血障碍或免疫排斥反应。由此可知，将人CD47在猪内皮细胞上的异位表达可以显著减少人类巨噬细胞对异种细胞介导的吞噬作用。此外，Paris等[20]发现异种肝移植在数分钟至数小时后会发生血小板减少症，主要是由于猪LSEC识别并结合半乳糖b1-4N-乙酰基葡萄糖胺(Galb1,4-NacGlc)糖蛋白通过去唾液酸糖蛋白受体1(recombinant asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1)介导发生结合和吞噬血小板，通过去唾液酸糖蛋白处理消除这种糖蛋白可降低血小板的吞噬作用。2015年，该团队使用TALEN技术敲除供体猪的ASGR1基因，结果显示ASGR1-/-猪肝脏在灌注期间吞噬的人血小板数少于家猪肝脏，说明供体猪ASGRI基因敲除可减少猪-人异种移植中血小板的吞噬，这对于异种肝移植中移植物的存活至关重要[21]。2016年，潘登科团队[22]成功制备出GTKO/ASGR1KO五指山小型猪，为解决异种肝移植后的血小板减少症这一问题提供了良好的基础材料。

除了排除固有免疫细胞介导的吞噬作用，还可以改造与凝血功能有关的基因位点来改善异种肝移植后的凝血功能障碍等问题。组织因子(tissue factor，TF)是异种肝移植诱导的耗竭性凝血病的主要驱动因素，而TF途径抑制因子(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)可抑制TF活性。Ahrens等[23]研究证实，与WT猪相比，TF的siRNA敲低猪的凝血时间显著增加，血栓形成减少。据报道[24]，窦科峰院士团队指出表达人TFPI的猪在临床前试验中已经出现了令人期待的结果。Pen等[25]体外检测了原代细胞对狒狒或猪血小板的聚集能力，发现猪LSEC对狒狒小板的吞噬作用最为明显，通过阻断vWF和整合素黏附途径可以阻止血发现小板聚集和吞噬作用。除此之外，向猪体内转入人血栓调节蛋白(human thrombomodulin，hTM)细胞可以在体外显著增强人活化蛋白C的表达[25]，但是来自hTM转基因猪的器官在肝脏中的表达最低，需要进一步优化猪肝脏中的hTM表达来评估这个基因改造对肝异种移植的作用[26]。此外，多项研究表明还可以通过表达人类抗血栓或抗凝基因例如CD39[27]、内皮蛋白C受体(hEPCR)[28]来减轻凝血级联激活引起的凝血功能障碍，提高异种移植的存活率。

通过对供体猪进行特定分子的改造可以减轻异种肝移植术后面临的急性排斥反应以及血小板减少症和TMA等凝血功能障碍等问题。为了改善猪移植物和人类免疫系统之间的免疫和生理分子不相容性，延长移植物的存活时间，可以通过单独或联合多种猪特异性抗原表位敲除、敲入人补体调节蛋白和凝血调节相关因子蛋白来开发基因工程猪[29]。2020年，窦科峰院士团队开展了13基因改良猪到恒河猴的异种肝移植试验，供体猪基因型为PERV-KO/GalT-KO/b4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hCD59/hb2M/hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39(PERV-KO/3-KO/9-TG)，移植物术后存活26 d，该研究验证了13基因猪可以抑制异种移植排斥和受体凝血异常，但此9基因的掺入并未完全避免异位辅助肝移植对异种移植物的损害[24]。此外，Cimeno等[13]通过体外灌注模型发现 ，GalTKO/hCD46/Neu5GcKO比GTKO/hCD46/hCD55/hEPCR/hTFPI/hCD47的猪肝的白蛋白表达水平更高。上述研究提示，虽然选择联合多种基因组合可以改善移植物的存活，但是基因组合并不一定是越多越好。因此，筛选较优的基因型组合非常重要。此外，Shah等[30]利用无pCMV的GTKO猪作为供体，并给予外源性人体凝血因子和共刺激阻滞剂调整抑制剂方案，术后受体未出现排斥、炎症或TMA，且实现了移植物存活时间长达29 d，这无疑为未来加速肝移植走向临床应用提供了一个有效的治疗思路。

2 人源化肝脏嵌合体猪

免疫排斥是异种移植中现存的主要障碍，但这主要针对功能性单一的器官，如本身承载较少的代谢和分泌的心脏、肾脏等[31]。而对于具有复杂性功能的器官，如肝脏、肺脏等，为实现移植物的长期存活，除了解决免疫排斥问题外还需对其他功能性基因进行人源化改造。目前的基因工程技术虽已取得一些突破性进展，但一次性定向改造所有基因仍是一项极具挑战的研究工作。目前，在猪体内培育人源化器官是一种较为可行的解决方案。

根据目前的研究，已经可以制备物种相近的嵌合体动物。2010年，美国和日本的研究团队[32-33]完成了大小鼠嵌合个体的制备，并成功在小鼠体内培育出大鼠的胰腺。但目前可成功培育物种差异大的嵌合个体较少。2017年，美国研究团队[34]开展了猪人嵌合体胚胎实验，观察时间为3～4周，结果表明人细胞占比约为1/100 000。2019年，我国研究团队[35]成功制备了2只猪猴嵌合体，新个体中嵌合的藏酋猴细胞比例为1/10 000～1/1000，虽然该比例仍很低，但这标志着嵌合体研究的巨大进步。即便异种嵌合体研究的目的是服务于人，且可以解决器官资源短缺问题，但仍会受到伦理道德的约束。例如在欧美部分国家，人体器官的嵌合体研究是被允许的，但在人与动物的嵌合体中，人细胞不能进入到动物的生殖系统和大脑中[36]。为了避免以上问题，可通过影像学结合手术的方式，对胚胎期仔猪的肝脏部位定向注射人源干细胞，由于人源干细胞提前转入了条件性自杀性基因，在进入其他组织时人源干细胞将会启动自杀程序，可以防止在非肝脏部位形成嵌合体[37]。

目前，嵌合体发育遇到的主要障碍是不同物种细胞间不能很好地形成免疫耐受，这一问题可通过培育免疫缺陷动物来提高嵌合比例。白介素受体亚基γ(interleukin 2 receptor subunit gamma，IL2RG)、重组激活基因(Recombination activating gene，Rag)1和Rag2是激活特异性免疫的关键基因，敲除后个体表现为T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞缺失且缺乏补体活性，通过这种方式可以获得一种重度免疫缺陷个体[38-39]。由于免疫缺陷动物的培育还需要在无菌环境下结合剖腹产手术完成，特别是临床级别的医用供体猪制备，所以此手术需在无指定病原体(designated pathogen free，DPF)超洁净级设施内开展。此外，对肝脏先天性损伤的猪胚胎进行人干细胞嵌合，能够在猪体内制备人源化肝脏。延胡索酸乙酰乙酸水解酶基因(fumarylacetoacetate hydrolase，FAH)的缺失将导致肝细胞中酪氨酸的毒性代谢产物无法正常代谢，持续性积累会引发肝损伤，造成Ⅰ型遗传性酪氨酸血症[40-41]。但在没有干预措施下，FAH基因敲除猪在妊娠期间即会导致胚胎致死，因此需要依赖特定的药物才能保证出生和存活。

综上所述，利用基因编辑技术在无菌环境下制备的GTKO/FAHKO/Rag2KO/IL2RGKO小型猪可以作为直接培育人源化器官的来源，这种方式也是解决异种肝脏移植物不能长期存活的一种可行方案。然而，培育人源化肝脏嵌合体猪是异种肝移植的技术高地，存在嵌合细胞占比低等问题。并且，该培育方式尚存较多技术难点，包括基因编辑技术、克隆技术和胚胎定向注射干细胞技术等均存在较大的挑战。此外，FAH敲除猪的药物维持剂量、剖腹产仔猪的人工培养方案等还需要进行深入研究，加之DPF净化设施的必要性，使整体研究投入较大且实验存在较多的不确定性。以上技术难点及其他各方面问题均制约了该方案的开展。但相信随着异种肾脏、心脏的移植逐步进入临床研究阶段并取得一定成果，将有更多的研究者致力于异种肝脏移植研究，人源化肝脏嵌合体猪也将成功培育。

3 小结与展望

随着基因编辑技术的发展，可以通过对供体猪进行基因改造和利用人源化细胞获得肝脏嵌合体来解决异种肝移植后的免疫排斥及生理功能不匹配的双重问题。首先，对于未来用于异种肝移植供体猪的基因型组合，笔者认为α-Gal，Neu5Gc对于抑制急性排斥反应是抗原敲除的必要选择，CD47以及ASGR1是抑制异种肝移植术后血小板减少症等的必需基因，对于人源补体调节蛋白可以采取单个或多个转入。与此同时，最重要的是要补充人体凝血因子及共刺激阻断剂等免疫抑制剂方案。通过以上方式不仅有希望大大改善异种肝移植的排斥反应，且可以延长移植物的存活时间，使得基因编辑猪可以更好地发挥“桥接过渡”的作用。其次，在无菌环境下利用基因编辑技术制备GTKO/FAHKO/Rag2KO/IL2RGKO小型猪可作为直接培育人源化器官的来源，这种方式是解决移植物长期存活问题的另一途径。虽然，目前培育人源化肝脏嵌合体猪面临着嵌合细胞占比低，基因编辑及克隆技术等问题。但随着越来越多研究者的关注和研究，相信人源化肝脏嵌合体猪和理想的多基因编辑猪也将被成功培育，以突破异种肝移植目前存在的障碍，推动异种肝移植向临床应用更靠近一步，为等待肝移植的患者和家庭带来福音。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：淮国丽负责献收集，撰写论及修改；杜嘉祥参与基因编辑部分内容的指导和修改；潘登科提供章思路，指导撰写及修改。