槐芩软膏介导NF-kB信号通路对小鼠痔疮模型肛缘水肿及创面愈合的影响*

赵俊卿 范荣荣 窦龙涛 房 磊 李少荣 彭 冀 王 茜

(1.邢台医学高等专科学校第二附属医院普外二科，邢台 054000)(2.邢台医学高等专科学校第二附属医院药品调剂科,邢台 054000) (3.邢台市内丘县人民医院外四科,邢台 054000)(4.河北中医学院,石家庄 050200)

痔疮是一种常见的由肛管血管垫的支持结构、静脉丛、动静脉吻合支发生病变或下移及齿线远侧静脉丛病理性扩张或血栓形成导致的临床多发病[1]。痔疮发病过程中伴随着大量炎性细胞浸润，形成局部炎性反应灶，引发坏死溃烂等。痔疮主要临床症状表现为肛周疼痛、瘙痒以及肛缘水肿[1-2]。目前临床上轻度患者治疗方法主要是采用药物治疗，而针对病情严重的内痔和混合痔患者，手术切除是常用的治疗方式[3]。虽然手术治疗能有效缓解病情，但是手术后肛缘水肿、疼痛以及切口愈合慢等严重影响患者的预后。因此，探究新型辅助痔疮手术治疗进而改善患者预后的药物受到了广泛关注。近些年研究表明，中药在痔疮的治疗过程中展现较好的疗效[4]。槐芩软膏，其成分是槐角(炒)、赤芍、牡丹皮、当归、防风、枳壳、黄芩、制川乌。具有清热止血，消肿止痛的功效，是一种常用痔疮治疗药物，用于Ⅰ、Ⅱ期内痔或混合痔治疗。但是槐芩软膏对痔疮术后肛周疼痛及水肿的影响尚不得知。本研究在小鼠痔疮模型上，探究痔术后使用槐芩软膏治疗对肛缘水肿和创面愈合的作用效果及机制，为临床上痔术后槐芩软膏的应用提供理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

10周龄雄性ICR小鼠30只(北京维通利华实验动物有限公司)，槐芩软膏(山东中大千方制药有限公司，国药准字Z20150074)；hs-CRP、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒(R&D System公司)；Hemoglobin ELISA试剂盒(Abcam公司)；山羊血清(中杉金桥有限公司)；兔抗小鼠Ly6G抗体和大鼠抗小鼠F4/80抗体(Abcam公司)；兔抗小鼠IkBα、兔抗小鼠磷酸化IkBα、兔抗小鼠p65抗体、兔抗小鼠GAPDH抗体、兔抗小鼠Lamin B1抗体(Abcam公司)；ECL发光液(赛默飞世尔公司)。

1.2 实验方法

1.2.1小鼠痔疮模型及治疗方法：在30只10周龄雄性ICR小鼠肛门内0.5 cm处推注0.05 mL 20%乙酸溶液。24 h后，具有肛周肿胀、白色溃烂面现象的小鼠即为造模成功小鼠[2]，总共24只。造模成功小鼠被随机分成两组，即对照组和治疗组，每组12只。治疗组小鼠在肛周组织使用低浓度高锰酸钾溶液清洗，然后涂抹槐芩软膏，每日1次，连续7 d；对照组小鼠给予低浓度高锰酸钾清洗。

1.2.2小鼠肛缘水肿及创面愈合面积评估：末次给药24 h后，对小鼠肛缘水肿进行打分，无水肿为0分，勉强可见为1分，边缘高于皮肤为2分，明显肿胀为3分；创面愈合率参照参考文献[5]测量创伤面积，并计算创面愈合率。愈合率=(原始创面面积-当前创面面积)/原始创面面积。

1.2.3ELISA检测hs-CRP、IL-6、TNF-α 水平及hemoglobin含量：末次给药24 h后，分别取治疗组和对照组小鼠外周血及肛缘组织。采用ELISA法检测各组小鼠血浆中hs-CRP、IL-6、TNF-α水平及组织中血红蛋白hemoglobin含量，具体方法参照hs-CRP、IL-6、TNF-α，hemoglobin ELISA试剂盒说明书。

1.2.4Real-time：PCR检测肛缘组织IL-6、TNF-α mRNA表达水平：末次给药24 h后，取两组小鼠肛缘组织。使用RIPA裂解液裂解组织，采用Trizol法提取组织中RNA，然后反转录获得cDNA，采用qPCR小鼠肛缘组织IL-6、TNF-α mRNA表达水平。IL-6 qPCR引物：上游5′-AGCCAGACGAGGCATGTT TA-3′，下游5′-TGGCTGGAGCTTGACACAAA-3′；TNF-α qPCR引物：上游5′-AGGCGGGCTAGTTAGCATTC-3′，下游5′-GGCCTTGGATGATAATGCAC-3′。

1.2.5肛缘组织HE染色和免疫荧光：末次给药24 h后，取两组小鼠(每组12只)肛缘组织。采用10%甲醛溶液固定组织24 h，然后将固定的组织脱水，石蜡包埋，制备石蜡切片。将制备的石蜡切片进行HE染色和免疫荧光染色。取石蜡切片，脱蜡、固定，山羊血清进行封闭，然后分别使用抗Ly6G抗体和抗F4/80抗体对组织中中性粒细胞和巨噬细胞浸润情况进行染色，洗片后再使用二抗室温孵育1 h；DAPI封片，荧光显微镜下观察拍照，每个样本选取10个视野，使用Image-Pro Plus 6.0软件分析每个视野下阳性细胞面积灰度值，然后取10个视野平均值，统计每组炎性细胞所占面积。

1.2.6Western blot检测肛缘组织IkBα及NF-kB p65水平：末次给药24 h后，取两组小鼠肛缘组织，使用核蛋白提取试剂盒对肛缘组织浆蛋白和核蛋白进行分离提取。收集提取液，加入蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE跑胶、转膜，转印蛋白的膜用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，之后抗小鼠IkBα抗体(1∶1 000)、小鼠磷酸化IkBα抗体、抗小鼠GAPDH(1∶1 000)抗体、抗小鼠NF-kB p65抗体(1∶1 000)及抗小鼠Lamin B1抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育12 h，然后使用HRP标记的二抗37 ℃孵育1 h，最后加入ECL发光液曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 槐芩软膏对小鼠肛水肿及创面愈合的影响

治疗7 d后，治疗组小鼠肛缘水肿评分相比于对照组显著降低，创面愈合面积及愈合率相比于对照组显著增加(P<0.05)，见表1。

表1 槐芩软膏对小鼠肛水肿及创面愈合的影响Table 1 Effects of Huaiqin ointment on anal edema and wound healing in mice

2.2 槐芩软膏治疗对小鼠外周血中炎性因子的影响

治疗7 d后，治疗组小鼠血浆中hs-CRP、IL-6、TNF-α水平相比于对照组显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠血浆hs-CRP、IL-6、TNF-α水平变化Table 2 Changes of plasma hs-CRP, IL-6 and TNF-α levels in each group

2.3 槐芩软膏治疗对小鼠模型肛缘组织中血红蛋白以及炎性因子表达的影响

治疗7 d后，结果显示，治疗组肛缘组织中血红蛋白Hemoglobin表达水平显著低于对照组(P<0.05)；real-time PCR显示治疗组肛缘组织中炎性因子IL-6、TNF-α mRNA水平显著低于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 各组小鼠模型治疗后肛缘组织血红蛋白以及炎性因子水平变化Table 3 Changes of hemoglobin and inflammatory factors in anal border tissue after treatment in each group

2.4 槐芩软膏治疗对小鼠模型肛缘组织病理学影响

治疗7 d后，病理染色结果显示，治疗组肛缘组织中炎性细胞浸润显著少于对照组(P<0.05)，见图1。

图1 槐芩软膏治疗对小鼠模型肛缘组织病理学的影响Fig.1 Effect of Huaiqin ointment on histopathology of anal margin in mouse model

2.5 槐芩软膏治疗对小鼠模型肛缘组织中性粒细胞和巨噬细胞浸润的影响

小鼠治疗7 d后，免疫荧光染色显示治疗组肛缘组织中中性粒细胞(图2A～B)和巨噬细胞浸润(图2C～D)显著少于对照组(P<0.05)，见图2。

注：A. 中性粒细胞免疫荧光代表图，蓝色：细胞核，绿色：中性粒细胞；B. 中性粒细胞面积定量结果；C. 巨噬细胞免疫荧光代表图，蓝色：细胞核，红色：巨噬细胞；D. 巨噬细胞面积定量结果。与对照组比较，*P<0.01Note：A. Neutrophil immunofluorescence diagram, blue: nucleus, green: neutrophil; B. Quantitative results of neutrophil area; C. Macrophage immunofluorescence representative diagram, blue: nucleus, red: macrophage; D. Quantitative results of macrophage area. Compared with the control group,*P<0.01图2 槐芩软膏治疗对小鼠模型肛缘组织中性粒细胞和巨噬细胞浸润的影响Fig.2 Effect of Huaiqin ointment treatment on neutrophil and macrophage infiltration in anal border tissue of mouse model

2.6 槐芩软膏治疗对小鼠模型肛缘组织NF-kB信号通路的影响

小鼠治疗7 d后，Western blot显示治疗组肛缘组织中IkBα磷酸化及核内NF-kB p65水平显著少于对照组(P<0.05)，见图3。

注：A. 组织IkBa磷酸化及核内NF-kB p65含量；B. Western blot条带定量结果，与对照组比较，*P<0.01Note: A. Phosphorylation of tissue IkBα and nuclear NF-kB p65 content; B. Quantitative results of Western blot bands,*P<0.01 compared with the control group图3 槐芩软膏治疗对小鼠模型肛缘组织IkBα磷酸化及核内NF-kB p65含量的影响Fig.3 Effects of Huaiqin ointment treatment on the phosphorylation of IkBα and the content of nuclear NF-kB p65 in anal border tissue of mouse model

3 讨论

痔疮是临床常见的肛肠疾病，根据痔核发生的位置可将其分为内痔、外痔和混合痔。针对病情严重的痔疮患者，手术是主要治疗方式，但是手术后患者发生的肛缘水肿给患者带来巨大的精神痛苦，且肛缘组织水肿充血严重减缓了手术切口的愈合、增加感染机会[6]。因此，痔术后使用合理有效药物治疗进而缓解手术引发的肛缘水肿是十分有意义的。由于肛门齿线附近的豁膜下层细小的动脉和静脉以直接吻合方式相连接而形成洞状静脉，而且痔外静脉丛与痔内静脉丛的细小分支也是互通的，所以痔手术伴随着对血管、淋巴管的离断及对局部组织的机械性创伤，造成局部炎性反应，进而引发齿线附近的淋巴、血液回流受阻进而引发水肿[7-8]。因此，活血化瘀、抑制炎性反应是用于痔术后治疗用药的主要特征。

槐芩软膏，其成分是槐角(炒)、赤芍、牡丹皮、当归、防风、枳壳、黄芩、制川乌。本研究使用槐芩软膏对模拟痔术小鼠模型术后肛缘水肿及创面愈合的作用效果进行研究，发现使用槐芩软膏治疗7 d后，小鼠的肛缘水肿评分和创面愈合情况相比于对照组得到显著改善。由于水肿组织血管通透性增加，会出现血液渗出现象，血液渗出现象跟水肿严重程度呈正相关。因此，我们通过检查肛缘组织中血红蛋白含量来检测肛缘组织水肿的严重程度[9]。结果发现槐芩软膏治疗能够显著降低肛缘组织中血红蛋白含量，表明槐芩软膏治疗能够显著改善模型小鼠肛缘水肿现象。槐角具有清热泻火、凉血止血，黄芩泻火解毒、止血、清热燥湿等功效；赤芍、牡丹皮、当归、黄芩均具有清热凉血、活血散瘀等功效[10-12]。因此，促进肛缘组织血管血液流通可能是槐芩软膏改善痔术后肛缘水肿的主要机制。

炎性反应在痔疮发病过程、痔术后肛缘水肿的恢复及创面愈合过程中扮演重要角色。研究表明，痔疮患者血清中炎性因子水平与患者痔疮病情呈正相关[13-14]。由于手术创伤，痔术后患者机体处于炎性反应状态，痔疮病情本身可引起出血、感染而促发炎性反应，手术引起的创伤可进一步加剧炎性反应程度[15]。hs-CRP是急性期反应蛋白，当机体发生炎性反应或感染时会急速上升；IL-6、TNF-α是常见的炎性反应细胞因子。研究发现，在痔疮及痔术后患者体内hs-CRP、IL-6和TNF-α显著升高[15]。本研究发现使用槐芩软膏治疗，可以显著降低小鼠血浆中hs-CRP、IL-6和TNF-α水平，进一步研究显示槐芩软膏能够显著减少肛缘组织中炎性细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)浸润并降低组织中炎性因子IL-6、TNF-α mRNA表达水平，表明槐芩软膏治疗可以降低患者痔术后体内炎性反应。NF-kB信号通路在炎性反应中扮演重要角色，其控制转录的DNA和细胞因子产生。静默状态下NF-kB分子与IkB分子结合在一起，分布在细胞浆中，当机体受到刺激后，IkB分子会发生磷酸化，磷酸化后的IkB与NF-kB分子分离，继而NF-kB分子进入核内调控生物学活动。研究发现，NF-kB信号通路通过促进水肿组织及创面中的炎性反应，阻碍组织水肿恢复及创面愈合[16-17]。本研究发现槐芩软膏治疗显著抑制肛缘组织中IkB磷酸化及核内NF-kB亚基p65水平，表明槐芩软膏可能是通过抑制NF-kB信号通路抑制水肿组织的炎性反应。

综上所述，槐芩软膏治疗能够显著改善小鼠痔术模型肛缘水肿，促进创面愈合，其分子机制可能是通过抑制NF-kB信号通路的激活进而抑制肛缘组织中炎性反应。本研究为槐芩软膏在痔术后的使用提供了实验依据。