不同遗传背景小鼠输卵管移植效率的研究

杜 淼 陈芳华 战大伟

(斯贝福(北京)生物技术有限公司，北京 102101)

胚胎移植又称受精卵移植，是指将雌性供体动物经过自然交配形成的早期胚胎或通过体外受(授)精技术获得的早期胚胎移植进另外一只雌性受体动物体内，使之进一步产生新个体的技术[1]。胚胎移植技术的实现可以充分发挥雌性动物的繁殖能力，大大缩短了雌性动物的繁殖周期，增加了供体动物一生可繁殖的后代数量。胚胎移植技术的成功有赖于动物的生理学基础[2]：(1)同种动物的供体和受体生殖器官的生理变化是相同的，为供体胚胎移入受体提供相同的生理环境；(2)早期胚胎在一定时间内可以处于游离状态而不影响其质量，为胚胎的收集提供了可能；(3)受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，为胚胎在受体内的存活提供可能；(4)供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受受体子宫环境的影响。

自英国人于1890年创立胚胎移植技术以来，胚胎移植技术已成为研究受精作用、胚胎学、遗传学以及生物净化的重要手段。以往的研究大都集中在单一遗传背景上，以研究封闭群居多。而本研究在不同遗传背景小鼠的基础上，探索胚胎数量对移植效率的影响，为从事繁育工作的科研人员提供一定的技术支持。

在本研究中，胚胎数量≤15枚时，采用输卵管单侧移植，胚胎数量为16～30枚时，采用输卵管双侧移植。

1 材料和方法

1.1 材料

动物：本实验所有的实验动物均来自斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物生产许可证号为：SCXK(京)2019-0010, 伦理审批号：2019012302。实验动物饲养在屏障和隔离设施中。光照明暗周期为12 h/12 h，自由饮水，自由采食。

试剂：孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin ，PMSG )注射液和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin ，HCG )注射液(宁波第二激素厂)；M2和石蜡油(Sigma Aldrich公司)；杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)(索莱宝公司)。

1.2 方法

1.2.1供体实验动物的超数排卵：选用性成熟的供体、受体动物。第1天16:00给雌性供体动物腹腔注射PMSG 10 IU，间隔48 h后，第3天16:00腹腔注射同样剂量的HCG。

1.2.2平衡培养液体：第4天根据超数排卵效率制作培养液滴：每个35 mm的培养基中做4个50 μL的M2液滴并覆盖石蜡油，放置温度为37 ℃、CO2浓度为5.0%的培养箱中过夜平衡。

1.2.3制备假孕受体鼠：第4天15:00将结扎雄性动物与性成熟雌性动物交配，第5天早上将有阴道栓的动物挑出供移植使用。

1.2.4收集胚胎：第5天将供体动物经75%乙醇消毒后取出输卵管(此过程需有两套手术镊和手术剪，一套用于剪开皮肤，一套用于收集输卵管，避免交叉污染)，利用DPBS冲洗液将胚胎从输卵管中冲出，利用捡卵针将胚胎移入经过平衡的M2培养液中。收集完所有胚胎准备移植。

1.2.5数据记录：记录每只受体动物的移植胚胎数与出生数量，计算产仔率。

2 结果

2.1 封闭群动物移植不同胚胎数量对产仔率的影响

就KM来讲，每只妊娠母鼠平均产仔率最高(52.6%)的移植胚胎数量是16～30枚，而ICR移植相同的胚胎数量平均产仔率(32.0%)则最低。ICR平均产仔率最高的移植胚胎数为11～15枚。同时，KM单侧移植的产仔率低于ICR，而双侧移植的产仔率则优于ICR。

表1 KM和ICR小鼠移植不同胚胎数量对移植效率的影响Table 1 Effect of different embryos transplanted on transplantation efficiency in KM and ICR

2.2 近交系动物移植不同胚胎数量对产仔率的影响

本实验小鼠移植胚胎数量≤15枚，C57BL/6J采用输卵管单侧移植方式，由表中结果可看出，输卵管单侧移植时，C57BL/6J的平均产仔率在50%左右(表2)。

表2 C57BL/6J小鼠移植不同胚胎数量对移植效率的影响Table 2 Effect of different embryos transplanted on transplantation efficiency in C57BL/6J

2.3 免疫缺陷动物移植不同胚胎数量对产仔率的影响

从免疫缺陷严重程度来讲，NOD-SCID的免疫缺陷程度比BALB/c-nu更为严重。由表3可看出，NOD-SCID具有移植胚胎数量的依赖性，当移植数量过少时，如≤10枚胚胎时，小鼠的平均产仔率为0。

表3 BALB/c-nu和NOD-SCID小鼠移植不同胚胎数量对移植效率的影响Table 3 Effect of different embryos transplanted on transplantation efficiency in BALB/c-nu and NOD-SCID

3 讨论

本研究分别选用封闭群KM和ICR、近交系C57BL/6J以及免疫缺陷模型鼠NOD-SCID和BALB/c-nu为研究对象。结果发现不同遗传背景动物之间移植效率有所不同。在保证胚胎质量和受体鼠生理状态完好的情况下，KM、ICR、C57、BALB/c-nu和NOD-SCID小鼠的最大产仔率分别是64%、73%、73%、50%和63.5%。

但是，本研究的数据与其他学者的数据会有所不同。如参考文献[3]中提到每只KM小鼠移植胚胎数量为15枚时，产仔率为16.6%；当移植胚胎数量为25枚时，产仔率为36%。不难发现，随着移植胚胎数量的增加，小鼠的平均产仔率也随之增加，这和本研究的实验结果是相一致的。

不同研究者实验结果不同的原因可能是由于胚胎质量引起的：有研究显示，超数排卵得到的胚胎质量比自然排卵的质量要差；同时，小鼠的移植方式也是造成移植效率不同的原因：如在C57BL/6J小鼠上，输卵管双侧移植效率略高于单侧移植效率，但无显著性差异[4]。胚胎质量、胚胎来源(鲜活胚胎/冷冻胚胎)、胚龄、受体动物的身体素质、生殖器官疾病(卵巢囊肿、子宫脓胀等)等均会影响移植效率，但是在胚胎移植过程中,移植的胚胎数量也是影响移植效率的重要因素[5-7]。为了提高实验动物的移植效率，本研究对实验动物移植胚胎数目与获得的仔鼠数目进行统计，从而分析出合适的移植胚胎数量，优化移植效率。本研究的实验结果确定了不同背景小鼠移植胚胎数量的最佳值，即：KM小鼠最佳移植胚胎数范围是16～30枚；ICR小鼠最佳移植胚胎数范围是11～15枚；C57小鼠最佳移植胚胎数范围是11～15枚；BALB/c-nu小鼠最佳移植胚胎数范围是≤10枚；NOD-SCID小鼠最佳移植胚胎数范围是11～15枚。根据本研究结果提示，当剩余胚胎数量较少时，可以采取胚胎冷冻的方法将胚胎储存，可有效的减少胚胎和假孕鼠的浪费。本研究成果可以提高同等技术条件下的胚胎移植效率，使早期胚胎得到最大程度的利用，保护优质的种子资源，为生物净化等工作者提供了切实可行的移植方法，具有一定的实际应用价值。