益母草碱调控LINC00461抑制宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡的实验研究

罗 娜，杨 启（.南阳市中心医院西药科，河南 南阳 473000；.南阳市中心医院肝脏普外科，河南 南阳 473000）

益母草是益母草干燥全草，具有活血调经、利水消肿、清热解毒之功效，临床常用于治疗月经不调、痛经闭经等。益母草碱是益母草中的生物碱，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和保护神经等作用[1-2]。研究发现，益母草碱对肺癌细胞具有增殖抑制和凋亡诱导的作用[3]，从而发挥抗肿瘤作用，但关于益母草碱对宫颈癌的抗肿瘤作用尚不明确。LINC00461是近年发现的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），在胶质瘤、肝细胞癌等组织中LINC00461表达上调，通过调控不同通路或miRNA参与癌细胞的增殖、凋亡和转移等过程，发挥致癌基因作用，这表明LINC0046有望成为肿瘤的潜在标志物[4-5]。本研究通过相关预实验发现，LINC00461在宫颈癌细胞中高表达，但具体作用机制尚不清楚。鉴于此，本研究以宫颈癌细胞株SiHa作为研究对象，探究益母草碱能否通过调控LINC00461影响宫颈癌细胞增殖、凋亡，以期为日后相关研究提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人宫颈癌细胞株SiHa购自美国模式菌种收集中心；盐酸益母草碱购自南京迪兆生物科技有限公司；胰蛋白酶购自美国Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Hyclone公司；Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂Trizol、Real-time PCR试剂盒、反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；CCK8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；LINC00461过表达载体（pcDNA3.1-LINC00461）和阴性对照pcDNA3.1载体购自上海吉玛制药有限公司；p21抗体、Caspase-3抗体和GAPDH抗体购自美国Santa cruz公司；Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国BD公司；BCA蛋白检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与药物处理 将SiHa细胞培养于含10% FBS、1%青-链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态，细胞培养至对数生长期，消化传代。将细胞培养至贴壁后，在培养液中加入终浓度为10、20、30 μg·mL-1的益母草碱，分别记为益母草A、B、C组，未经过益母草碱处理的细胞作为对照组，继续培养72 h，收集细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染 将处于对数生长期的SiHa细胞，以1 ～ 2×l05个·孔-1细胞接种于6孔板，当融合度为80%～ 90%时，分别将pcDNA3.1-LINC00461和pcDNA3.1转染SiHa细胞，对应设为pcDNA3.1-LINC00461组和pcDNA3.1组。pcDNA3.1-LINC00461和pcDNA3.1转染SiHa细胞后，加入30 μg·mL-1益母草碱，记为益母草C + pcDNA3.1组、益母草C + pcDNA3.1-LINC00461组，转染48 h后，收集细胞进行实验或药物处理。

1.2.3 Real-time PCR检测LINC00461相对表达量 收集各组SiHa细胞，采用Trizol试剂提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，按照Real-time PCR的说明书进行反应合成LINC00461和mRNA。LINC00461上游引物：5'-GACATTTACGCCACAACCCACG-3'，下游引物：5'-AGACAGACCCTCAGATTCCCCA-3'；GAPDH上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCATCA-3'，下游引物：5'-TGATGGCATGGACTGTGGTC-3'。运用2−ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.4 CCK8实验检测细胞存活率 收集转染、益母草碱处理72 h后的SiHa细胞，以2×103个·孔-1（100 μL细胞）接种于96孔板中，加10 μL CCK8溶液，培养2 h，酶标仪测定450 nm吸光度（A）值。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.2.5 克隆形成实验 将药物处理或转染后的SiHa细胞以每皿约100个接种于细胞培养皿中，加入10 mL培养液混匀，培养至出现肉眼清晰可见的细胞克隆（约10 ～ 14 d），弃培养液，洗涤细胞2次，甲醛固定细胞，结晶紫染色，计数。

1.2.6 流式细胞术测定细胞凋亡率 将SiHa细胞以2×105个·孔-1接种于6孔板，培养24 h，用益母草碱处理72 h，消化收集细胞，按照凋亡试剂盒说明书进行操作，加入5 μL膜联蛋白V-FITC和5 μL碘化丙啶，避光20 min，使用流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.7 Western blot实验 将转染的、益母草碱处理的各组SiHa细胞进行裂解收集蛋白。将蛋白样本进行SDS-PAGE，转膜，封闭1 h，加一抗（p21 1∶1000稀释，Caspase-3 1∶1000稀释），4 ℃孵育过夜，加稀释的二抗，室温孵育1 h。以GAPDH为内参照，分析蛋白水平。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 19.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度益母草碱对SiHa细胞增殖和凋亡的影响

与对照组相比，益母草碱A、B、C组细胞存活率、克隆形成数均降低，细胞凋亡率升高，p21和Caspase-3蛋白表达量均升高，且具有剂量依赖趋势（P < 0.05），见表1。根据结果，后期实验选用存活率约为50%的益母草碱浓度（30 μg·mL-1）。

表1 不同浓度益母草碱对SiHa细胞增殖和凋亡的影响. n = 9Tab 1 Effect of different concentration of leonurine on proliferation and apoptosis of SiHa cells. n = 9

2.2 益母草碱对SiHa细胞中LINC00461相对表达量的影响

对照组SiHa细胞中LINC00461的相对表达量为（1.00±0.05），益母草C组SiHa细胞中LINC00461的相对表达量为（0.35±0.03），与对照组相比，益母草C组SiHa细胞中LINC00461的相对表达量降低（t =33.442，P < 0.05）。

2.3 过表达LINC00461对SiHa细胞增殖和凋亡的影响

结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-LINC00461组LINC00461相对表达量升高，p21和Caspase-3蛋白表达降低，凋亡率下降，细胞存活率和克隆形成数升高（P < 0.05），见表2。

表2 过表达LINC00461对SiHa细胞增殖和凋亡的影响. n = 9Tab 2 Effect of over-expression of LINC00461 on proliferation and apoptosis of SiHa cells. n = 9

2.4 过表达LINC00461对益母草碱作用的SiHa细胞增殖的影响

结果显示，与对照组相比，益母草C组p21蛋白表达量升高，存活率和克隆形成数均降低（P <0.05）；与益母草C + pcDNA3.1组相比，益母草C +pcDNA3.1-LINC00461组p21蛋白表达量降低，存活率和克隆形成数均升高（P < 0.05），见表3。

表3 过表达LINC00461对益母草碱作用的SiHa细胞增殖的影响. n = 9Tab 3 Effect of over-expression of LINC00461 on proliferation of SiHa cells treated with leonurine. n = 9

2.5 过表达LINC00461对益母草碱作用的SiHa细胞凋亡的影响

结果显示，与对照组相比，益母草C组Caspase-3蛋白表达量和细胞凋亡率均升高（P < 0.05）；与益母草C + pcDNA3.1组相比，益母草C + pcDNA3.1-LINC00461组中Caspase3蛋白表达量和细胞凋亡率均降低（P < 0.05），见表4。

表4 过表达LINC00461对益母草碱作用的SiHa细胞凋亡的影响. n = 9Tab 4 Effect of over-expression of LINC00461 on the apoptosis of SiHa cells treated with leonurine. n = 9

3 讨论

益母草中包含生物碱、酚酸、二萜和黄酮类化合物，具有抗氧化、抗癌、保护神经、心脏和子宫的作用[6]。益母草根提取物能促进胶质瘤细胞凋亡[7]。益母草乙醇提取物以剂量和时间依赖方式诱导乳腺癌细胞凋亡[8]。益母草提取物可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，益母草冲剂可增强Ⅲ～Ⅳ期宫颈癌单纯放疗患者的疗效[9-10]。益母草碱是从益母草中提取的生物碱，本研究旨在评价益母草碱对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响。本研究结果显示，不同浓度的益母草碱对SiHa细胞的存活、克隆形成均具有抑制作用，对细胞凋亡有促进作用，且呈剂量依赖性。Caspase-3是细胞凋亡发生的执行因子，研究表明Caspase-3表达与宫颈癌癌灶体积呈负相关，提高Caspase-3表达能够缩小癌灶体积[11]。p21通过抑制细胞周期蛋白激酶复合物的活性，抑制DNA复制和修复，阻碍细胞周期转换，具有抑癌作用[12]。本研究显示，益母草碱呈剂量依赖关系提高p21和Caspase-3表达，与功能实验结果吻合。以上结果表明，益母草碱能抑制宫颈癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。

lncRNAs由长度超过200个核苷酸的非编码RNA组成，与细胞周期、增殖、生长、凋亡、转移和侵袭等过程密切相关[12]。研究表明，LINC00461高表达与肾细胞癌患者低生存率有关[13]。LINC00461高表达可促进癌细胞增殖、迁移和侵袭[14-17]。LINC00461高表达可能是肺癌细胞放疗抵抗和结直肠癌顺铂耐药的重要原因[18-19]。为进一步探讨益母草碱对宫颈癌的分子机制，本研究检测益母草碱对SiHa细胞LINC00461表达的影响，结果显示30 μg·mL-1益母草碱可降低SiHa细胞LINC00461表达水平，提示益母草碱的抗宫颈癌作用可能与抑制LINC00461表达有关。过表达LINC00461后，SiHa细胞存活率、克隆形成能力增加，细胞凋亡率降低，说明LINC00461在宫颈癌中具有致癌作用。此外，过表达LINC00461还可逆转益母草碱对SiHa细胞存活、克隆形成、凋亡以及相关蛋白表达的影响，这进一步说明益母草碱通过抑制LINC00461发挥抗宫颈癌作用。

综上，益母草碱通过抑制LINC00461能够抑制宫颈癌SiHa细胞增殖，促进细胞凋亡，这为益母草碱在宫颈癌治疗中的应用提供了理论支持。本实验也存在局限性，研究着重体外细胞实验，关于体内动物实验需要进一步实验探究。