香味基因和稻瘟病抗性基因在空育131中的聚合改良

李瑞琪 毕浩然 姜恭好 段海燕

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，150080，黑龙江哈尔滨；2黑龙江大学生命科学学院，150080，黑龙江哈尔滨）

培育高产、优质、抗性高和广适性强的水稻品种是现在水稻育种工作的重要目标[1]。空育131是黑龙江省的主要水稻栽培品种，其生育期较短，具有结实率高、耐冷害能力强、田间抗性强、出米率高和米质优等诸多优良性状[2]。对该品种进行持续的遗传改良，补足品种短板，继续发挥品种的优异环境适应性，对黑龙江省的水稻高产稳产具有重要意义。

稻瘟病是一种水稻真菌性病害，每年都会造成严重的粮食产量损失[3]。近年来，由于稻瘟病生理小种的变化，空育131在黑龙江省的稻瘟病抗性严重退化，在生产上表现为抗性差和抗谱窄。经过鉴定，空育131本身携带Pik和Pia稻瘟病抗性基因[4]，但不能满足黑龙江省当前稻瘟病抗性育种的需要，迫切需要引入新的具有广谱抗性的基因。另外，由于空育131的稻米不具有香味，与当下对香米市场的需求不相适应，也有必要通过分子育种的手段对这2个性状加以改良。

Pi1是位于第11号染色体上的来源于利比亚粳型品种LAC23的广谱稻瘟病抗性基因[5]。Pi2是位于第6号染色体上的来源于籼稻品种5173的高抗稻瘟病基因[6]。Pi9同样是位于第6号染色体上的来源于小粒野生稻（Oryza minuta）的抗稻瘟病基因[7]，它对来自13个国家的43个稻瘟病菌株都表现出了很高的抗性[8]。Pi2和Pi9都被认为在水稻抗稻瘟病实践中具有较高的利用价值。位于水稻第8号染色体上的Osbadh2（LOC＿Os08g32870）是一个重要的香味调控基因[9]。Osbadh2基因不同部位的缺失或插入会导致该基因功能丧失，分泌出香味物质2-乙酰基-吡咯啉（2AP），使稻米产生香味[10]，fgr是编码甜菜醛脱氢酶（OsBADH2）的Osbadh2基因的隐性突变等位基因，导入该基因可以使稻米产生浓郁的香味品质[11-12]。

本研究采用基因聚合育种的方法，利用以上4个（Pi1、Pi2、Pi9和fgr）基因对空育131的香味品质和稻瘟病抗性2个性状进行遗传改良，为培育食味品质和抗病能力都有所加强的新空育131提供材料基础。

1 材料与方法

本试验将来源于4个供体的1个香味基因和3个抗稻瘟病基因，即DHX2（fgr）和HLJ2（Pi1）、HLJ7（Pi2）、HLJ16（Pi9）分别导入空育131中，再将香味基因改良系KY（fgr）与稻瘟病抗性基因改良系KY（Pi1）、KY（Pi2）和KY（Pi9）分别杂交，其杂交组合为Pi1+fgr、Pi2+fgr和Pi9+fgr。以野生型空育131（KY131）作对照，对杂交F2和F3代通过分子标记PCR进行基因型筛选鉴定。fgr所用引物为BadF4和BadR4；Pi1所用引物为RM27322-F和RM27322-R；Pi2所用引物为L11-F和L11-R；Pi9所用引物为L7-F和L7-R。引物序列均由华中农业大学何予卿老师提供。并对筛选出的F3代株系进行香味特征与稻瘟病抗性验证。

利用RCIE6K芯片（中国种子集团有限公司）对所获得的遗传材料进行背景分析。RICE6K芯片是基于全基因组单核苷酸多态性（SNP）阵列原理，根据520份世界微核心水稻种质资源测序的结果，总共包含获得5636个SNP标记（包含少量的InDel插入/缺失标记），经过合成和测试，最终有4473个高质量标记具有良好的基因分型效果[13]。主要操作步骤包括DNA提取和PCR特异性扩增、扩增产物的片段化、芯片杂交、单碱基延伸、染色和扫描（由中国种子集团有限公司完成）。农艺性状调查，包括分蘖数、穗长、单穗粒数、单株粒重、千粒重和结实率。

采用混合蒸煮法验证香味基因改良系KY（fgr）的香味品质，将以上3种株系与野生型空育131的稻米进行不同比例的混合，蒸煮之后品尝混合稻米的香味等级。采用苗期混合接种稻瘟病孢子的方法检验双基因聚合株系对稻瘟病的抗性，用来自中国种子集团有限公司的稻瘟菌菌株分别接种Pi1+fgr、Pi2+fgr、Pi9+fgr以及感病对照KY131，观察并记录对稻瘟病的抗性等级。稻瘟病病情分级标准按照国际水稻研究所制定的稻瘟病抗性评价叶瘟分级标准[14]，共分为9级，从0级到9级病情逐渐加重。0级无病害症状；3级是叶片上出现小而圆以至稍长的褐色坏死灰斑，直径1～2mm；4级是叶片上出现典型的稻瘟病斑或椭圆型病斑，长1～2cm，常限于2条叶脉间，病斑面积不足叶面积的2%；对照KY131为6级，表现为叶片上有典型的稻瘟病病斑，受害面积为10%～25%。

2 结果与分析

2.1 双基因聚合F2代基因型鉴定

F2代中每组选取200个单株，通过分子标记PCR最终筛选出21株双基因聚合的纯合单株。其中，KY（Pi1+fgr）植株6株，KY（Pi2+fgr）7株，KY（Pi9+fgr）8株，具体结果如表1和图1所示。

表1 双基因聚合F2代筛选结果Table 1 Identification pyramided genes of F2generation of double genes polymerization plants

图1 双基因聚合F2代PCR鉴定结果Fig.1 The PCR identificationto of F2generation of double-gene polymerization individuals

2.2 双基因聚合F3代香味基因验证

由基因F2代筛选结果（表2）表明，具有香味基因fgr的KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）的改良系空育131已经具有了香味品质。随着香味基因改良系KY（fgr）所占比例的增加，混合稻米的香味等级也不断提升。

表2 双基因聚合植株F3代香味品质鉴定Table 2 Aroma quality appraisal of F3generation of double genes polymerization plants

2.3 双基因聚合F3代稻瘟病抗性验证

由表3可得，改良系KY（Pi1）、KY（Pi2）和KY（Pi9）均提高了水稻叶瘟的抗性等级，其中对水稻叶瘟的抗性有明显提升作用的改良系是KY（Pi1）和KY（Pi2），相对于CK（KY131）均提升了3级；KY（Pi9）对稻瘟病的抗性提升了2级，改良系KY（Pi9）对水稻稻瘟病抗性的改良稍逊于KY（Pi1）和KY（Pi2）。

表3 双基因聚合植株F3代稻瘟病抗性鉴定Table 3 Rice blast resistance identification of F3 generation of double genes polymerization plants

2.4 双基因聚合的F3代基因芯片分析

由图2可知，3种组合中大面积为透明区域，在第8号染色体上均有红色区域，表明KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）在第8号染色体上与KY131存在纯合差异位点，即香味基因fgr所在位点与KY131存在多态性。在KY（Pi1+fgr）组合中，第11号染色体上存在红色区域，表明该组合中第11号染色体上与KY131存在差异位点，即稻瘟病抗性基因Pi1所在位点与KY131存在差异；在KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）组合中第6号染色体上存在红色区域，表明在KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）的组合中，在第6号染色体上与KY131存在纯合差异位点，即Pi2和Pi9所在的位点与KY131存在多态性。

图2 双基因聚合单株基因芯片分析结果Fig.2 Analysis results of gene chip in double gene polymerization individuals

综上可得，KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）、KY（Pi9+fgr）与KY131之间除目标基因外，只有部分基因位点与KY131存在多态性，其余基因位点都与KY131保持高度一致，实现了香味性状与稻瘟病抗性的精准改良。

2.5 双基因聚合的F3代农艺性状调查

由基因芯片分析结果可知，目标基因Pi1、Pi2、Pi9和fgr已成功聚合于KY131中，且Pi2、Pi9和fgr为纯合聚合。亲本材料为KY（Pi1）导入系、KY（Pi2）导入系、KY（Pi9）导入系和KY（fgr）导入系，除目标区段外，其余背景与野生型KY131一致，在F2代筛选出的双基因纯合株系在F3代仍是双基因纯合的情况，遗传稳定。对双基因聚合KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）和 KY（Pi9+fgr）株系进行农艺性状调查，结果（表4和图3）表明，双基因聚合株系与KY131的各个农艺性状没有明显差异，说明改良型植株仅仅改变了目标性状，其他性状并未发生改变，双基因聚合型KY131依然保留了野生型KY131自身的优良性状。

表4 双基因聚合植株F3代农艺性状调查Table 4 Investigation of agronomic traits of F3generation in double-gene polymerization plants

图3 双基因聚合植株F3代农艺性状Fig.3 Agronomic traits of F3generation of double genes polymerization plants

3 讨论

随着种植环境和年份的变化，稻瘟病病菌很容易发生变异，连续多年种植单一抗性品种会导致抗性逐渐减退，甚至可能丧失[15]。近些年，水稻品种的稻瘟病抗性越发引起人们关注，已经成为品种审定的一项标准[15]。KY131本身携带Pik和Pia基因，2003年之前在黑龙江省是比较抗病的品种。但目前，KY131在黑龙江省对稻瘟病抗谱窄、抗性差。本研究中与稻瘟病抗性相关的3个基因均具有广谱抗性。导入上述3个基因的KY131的稻瘟病抗性分别提高了2～3级，其中Pi9提高了2级，Pi1和Pi2提高了3级。因此在水稻抗病育种中优先选择Pi1和Pi2基因效果更佳。

香味性状是稻米品质的重要评价指标，香稻育种成为现代水稻育种的重要方向之一[16]。本研究中选择的水稻香味基因fgr来源于稻花香2号，结果表明，导入KY（fgr）香味基因的材料品质也得到了提升。因此在水稻品质改良中fgr基因可以有效地改善香味品质，更好地提高稻米品质。

基因聚合是将分子标记辅助选择育种与传统育种方式相结合的育种方式，利用与目标性状紧密连锁的分子标记，对改良型目标群体进行基因型鉴定，可以精准地选择目标基因，聚合多个目标基因，极大地缩短育种年限，提高育种效率，已成为目前育种工作中重要的方法[11,17]。本研究以水稻品种KY131为受体，用基因聚合的方法将抗病基因和香味基因聚合于KY131中，改良其抗稻瘟病抗性及香味特征，以达到延长优良品种的利用年限，使其更加适应市场的需要。结果表明，基因聚合后的KY131的稻米具有香味，稻瘟病抗性也有效提高，农艺性状无明显变化。基因聚合后的KY131具有寒区水稻种植资源推广应用的可能性，可为选育、改良品质和抗病效果更好的抗稻瘟病香稻品种提供资源信息和亲本材料。

4 结论

将KY（fgr）分别与KY（Pi1）、KY（Pi2）、KY（Pi9）杂交，杂交亲本均是KY131的改良系，遗传背景相似度极高，避免了杂交过程中的连锁累赘，增加了聚合育种的效率和遗传背景的纯净度。将香味基因与稻瘟病抗性基因聚合于KY131中，得到了3种香味基因和抗病基因聚合的纯合植株，基因型分别为Pi1+fgr、Pi2+fgr和Pi9+fgr，在改良系的后代植株中，香味品质得到了大幅提升，对稻瘟病的抗性提高了2～3级，成功选育出了香型抗病的双基因聚合改良系KY131，对水稻高品质抗病育种具有重要的实践意义。