稻瘟灵单克隆抗体的制备及评价

王幸幸，王耀宇，李晓娜，申超群，周 凯，2*，张 静

（1．深圳市通量检测科技有限公司，广东 深圳 518038；2．九江学院 江西油茶研究研究中心，江西 九江 332005；3．烟台海关技术中心，山东 烟台 264000）

稻瘟灵（Isoprothiolane）又名异丙硫环、富士一号，化学名称为1，3-二硫戊环-2-亚基丙二酸二异丙酯，是对光和热较稳定的有机硫环状杀菌剂，具有内吸性，属高效内吸杀菌剂［1］，主要用于防治水稻病菌及虫害（如稻飞虱、叶蝉）。同时也是水稻稻瘟病的特效药剂，对水稻纹桔病和白叶标桔病有一定的防治效果，是一种高效、低毒、低残留的有机杀菌剂［2］。水稻植株吸收稻瘟灵后会累积于叶组织，易于集中在穗轴和枝梗处，并污染大米及周围环境［3］。近年来，随着稻瘟灵的大量施用，一部分稻瘟灵会进入土壤，造成土壤中的农药残留，也会对土壤功能产生一定影响［4］，并进一步污染作物。为了预防稻瘟灵过量施用可能存在的安全风险，GB 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》［5］中规定了玉米、稻米，甚至西瓜中稻瘟灵的残留限量，其最低限量为0．05 mg/kg。

目前国家标准一般采用气相色谱或与质谱联用方法将稻瘟灵与其他农药同时检测［6-8］，由于不同农药性质各异，采用单一提取同时检测的方法不可避免地影响检测稳定性。尽管近年来气相色谱、液相色谱等仪器分析方法的检出限与稳定性均有一定程度提高［3，9-10］，但这些方法样品前处理复杂，无法满足快速、大通量的检测要求。

免疫分析方法操作简便、快捷、通量高、灵敏度高，已经成为食品安全快速检测的主要方法之一［11］。抗体是免疫分析方法的重要因素，抗体质量影响检测的灵敏度与准确性。目前仅有的1例稻瘟灵抗体制备的报道［12］是将丙二酸二异丙酯中酯键水解后偶联蛋白，但两个双键水解并同时偶联蛋白将大大影响抗体制备的成功率和特异性，且该方法制备的抗体与对硫磷等农药的交叉反应率超过20%。本研究基于稻瘟灵的分子特征，合成了稻瘟灵半抗原，并与蛋白偶联制备抗体，通过常规免疫与杂交瘤细胞融合，成功筛选得到特异性识别稻瘟灵的单克隆抗体，并以此为基础建立了稻瘟灵的快速免疫检测方法，为检测试纸条等产品的开发提供了依据。

1 实验部分

1.1 试剂、材料与仪器

弗氏完全/不完全佐剂、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、TLC薄层层析板（GF254）、辣根过氧化物酶（HRP）、3，3＇，5，5＇-四甲基联苯胺（TMB）均为Sigma公司产品，稻瘟灵等农药标准品（德国Dr．Ehrenstorfer GmbH），N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐（EDC-HCl）、磷酸盐缓冲液（PBS）、羰基二咪唑（CDI）均购于阿拉丁试剂（上海）有限公司。Balb/c小鼠，雌性，8~9周龄，体重20~25 g。普通级雌性昆明鼠（广东省实验动物中心）；鼠骨髓瘤细胞SP2/0保存于本实验室。

旋转蒸发仪（日本，东京理化），Multiskan MK3酶标仪、二氧化碳培养箱（美国Thermo），倒置显微镜（日本Olympus）。酶标板自动洗涤机（美国Bio-tech），质谱仪（美国，AB）。

1.2 实验方法

1.2.1 半抗原的合成及鉴定稻瘟灵半抗原与抗体的合成路线如图1所示，将1．6 g氢氧化钠溶于10 mL水中，于10~20℃下将1．52 g二硫化碳和3．76 g二异丙基丙二酸酯混合液缓慢搅拌滴入。室温下搅拌1 h后，加入25 mL水和5．16 g 2，3-二氯-1-丙醇，加热至70℃，反应完成后，用醚抽取，经水洗、干燥、过柱提纯得到稻瘟灵半抗原1。

图1 稻瘟灵半抗原与抗体合成路线图Fig．1 The synthesis schemes of isoprothiolane hapten and antigen

在25 mL单口瓶中加入半抗原1及等摩尔质量的丁二酸酐，再加入10 mL无水吡啶并升温至80℃反应5 h，以TLC板监控原料反应完全后停止反应。蒸干吡啶后，浓缩物直接过柱纯化得终产物。将上述合成的半抗原2于质谱负离子模式下进行测定。

1.2.2免疫原与包被原的制备免疫原及包被原的制备均参考文献［13-14］。

活泼酯法制备免疫抗原（稻瘟灵-BSA）：称取70 mg稻瘟灵半抗原2溶于3 mL DMF中，加入36 mg NHS、41 mg EDC-HCl，室温搅拌反应6 h，离心后备用。称取64 mg BSA溶于3．2 mL硼酸缓冲液（0．1 mol/L，pH 9．0）中，缓慢滴加0．9 mL上述离心后的活化液，室温反应4 h。采用PBS（0．01 mol/L，pH 7．4）进行透析，每4 h换液1次，换液7~8次后，于4 000 r/min条件下离心5 min，上清液于-20℃保存。

混合酸酐法制备包被抗原1（稻瘟灵-OVA-1）：准确称取5．4 mg稻瘟灵半抗原2溶于200 μL DMF中，按顺序分别加入4．27 μL三正丁胺和2．34 μL氯甲酸异丁酯，室温下搅拌反应1 h，离心后备用。将30 mg OVA溶于2 mL碳酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢滴加100 μL上述离心后的活化液，室温下搅拌反应3 h，透析与保存步骤与活泼酯法制备免疫抗原稻瘟灵-BSA一致。

CDI法制备包被抗原2（稻瘟灵-OVA-2）：将10 mg稻瘟灵半抗原1与15 mg的CDI溶解于2 mL吡啶中，在室温、避光条件下搅拌反应120 min后，蒸干溶剂。取0．5 mL的DMF溶解上述活化的稻瘟灵半抗原1，并缓慢滴入OVA溶液（60 mg OVA溶于4 mL 0．1 mol/L的Na2CO3溶液中），同时不断搅拌，室温下避光反应2 h，透析与保存步骤与活泼酯法制备免疫抗原稻瘟灵-BSA一致。

1.2.3 免疫方案取8周龄Balb/c雌性小鼠3只，将制备的免疫抗原与弗氏完全佐剂等量混合，完全乳化后，在小鼠腹部皮下进行多点注射，剂量为100 μg/只。每隔3周取免疫抗原与弗氏不完全佐剂等量混合，完全乳化后采用相同方式进行多点注射，免疫4次后取免疫小鼠血清，采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清效价与抑制率。选取效价和抑制率均较高的小鼠，取小鼠脾脏进行细胞融合，融合前5 d以两倍免疫剂量强化免疫一次。

1.2.4 细胞融合及单克隆抗体制备小鼠脾细胞制备、与骨髓瘤细胞融合、阳性杂交瘤细胞淘筛等过程与Liu等［15］的方法一致。将筛选到的单个阳性克隆抗体扩培后于液氮中保存。

1.2.5 腹水制备与抗体纯化提前一周注射0．5 mL液体石蜡至昆明鼠腹腔中。将上述筛选的阳性克隆抗体扩培并收集，通过腹腔注射入小鼠腹部，10~15 d后，待小鼠腹部明显膨大时采集小鼠腹水。采用饱和硫酸铵沉淀法除去杂蛋白，使用protein A柱纯化出抗体IgG。

1.2.6 间接竞争ELISA及包被原的筛选间接竞争ELISA法（icELISA）操作过程参考文献［16］。采用棋盘滴定法优化包被抗原浓度与抗血清工作浓度，以不同浓度的稻瘟灵-OVA-1、稻瘟灵-OVA-2分别包被酶标板，小鼠抗血清倍比稀释。选择吸光值为1．0左右时的抗原浓度和抗体稀释度作为工作浓度。

1.2.7 icELISA标准曲线的建立与特异性分析在优化实验条件下，以稻瘟灵质量浓度的对数为横坐标，B/B0为纵坐标（其中B为添加稻瘟灵时的OD值，B0为空白组的OD值），采用OriginPro 8．5软件按照四参数对数拟合绘制稻瘟灵检测标准曲线。选择与稻瘟灵结构相似的其他农药和化合物对建立的ic-ELISA方法进行特异性评价。

1.2.8 样品前处理与加标回收实验选取经GB 23200．113-2018［6］检测为阴性的蔬菜与谷物样品进行加标回收实验。蔬菜样品取可食部分充分剁碎混匀，谷物样品直接粉碎备用。分别按50、100、200 ng/g的比例添加稻瘟灵标准品溶液，每个水平做3个平行。称取2 g加标样品，加入4 mL乙酸乙酯振荡提取10 min，4 000 r/min离心20 min，收集有机层，加入1 g无水硫酸钠振荡1 min除水后，取上层有机相2 mL旋转蒸发至干。用含甲醇5%的PBS缓冲液2 mL充分复溶。

2 结果与讨论

2.1 半抗原设计、合成与鉴定

由于稻瘟灵分子本身不含可以偶联的活泼基团，无法直接偶联蛋白。根据其分子特征，在二硫杂环戊烷中引申出活泼基团可最大限度地保留稻瘟灵分子结构。在合成其半抗原时引入一个带有羟基的基团，再通过该基团和酸酐反应制备出带有羧基的半抗原，可进一步延生手臂，将目标分子暴露。其最小能量构象下的分子静电势能面图（图2）显示，半抗原中引入的活泼基团并未对稻瘟灵分子静电势能产生影响，且半抗原2的手臂足以将分子暴露。半抗原1与2手臂的部分长度和静电势能差异较大，结合异原包被可提升抗体与药物的识别强度［17］，故将半抗原2用于免疫原合成，以半抗原1制备包被原。经过3步反应，制备出稻瘟灵半抗原1与半抗原2。经质谱（负离子模式）鉴定（图3），半抗原1为m/z319．1［M-H］-，半抗原2为m/z419．3［M-H］-。

图2 稻瘟灵（A）及其半抗原1（B）和半抗原2（C）分子最小能量构象下的分子静电势能面图Fig．2 The electrostatic potential energy surfaces of the molecule in the minimum energy conformation of isoprothiolane（A）and its hapten 1（B）and hapten 2（C）molecules

图3 稻瘟灵半抗原1（A）和半抗原2（B）的负离子质谱图Fig．3 Negative ion mass spectrograms of isoprothiolane hapten 1（A）and hapten 2（B）

2.2 抗血清效果分析

免疫的3只小鼠均产生免疫应答，即产生了相应抗体。采用棋盘滴定方式，选择空白药物时吸光值接近1．0且抑制率最大的抗血清与包被原质量浓度作为最佳工作浓度，其中包被原质量浓度均为1 μg/mL，抗血清结果显示小鼠B的效价最高，达25 000。以500 μg/L稻瘟灵标准品作为抑制药物，对不同小鼠的血清进行icELISA检测。如表1所示，小鼠B的血清抑制率最高达82．88%，完全满足要求。综合考虑选择小鼠B进行细胞融合，并选择稻瘟灵-OVA-2作为筛选的包被原。

表1 稻瘟灵抗血清抑制效果Table 1 Inhibitory effect of isoprothiolane antiserum

2.3 抗体灵敏度测定

经过细胞融合筛选，发现有一个孔中的上清液可被稻瘟灵明显抑制。结合显微镜克隆法与有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞进行筛选，获得一株能稳定产生抗稻瘟灵抗体的杂交瘤细胞株，将制得的单克隆抗体记为mAb-DWL。收集小鼠腹水产生得到的抗体，测得其质量浓度为5．2 mg/mL。采用最大抑制法筛选最适包被质量浓度与抗体稀释倍数，结果显示当包被质量浓度为1 μg/mL，抗体稀释倍数为1∶100 000时，抑制率最大（91．8%）。在最佳包被质量浓度与抗体稀释倍数下，建立稻瘟灵的icELISA抑制曲线，如图4所示，获得半抑制浓度（IC50）为55．2 ng/mL，线性范围（IC20~IC80）为4．6~530．2 ng/mL，满足国标GB 2763-2021［5］对稻瘟灵的最大限量要求（玉米0．05 mg/kg、大米1 mg/kg、西瓜0．1 mg/kg）。

图4 基于mAb-DWL的稻瘟灵间接竞争ELISA标准曲线Fig．4 The standard curve of the indirect competition ELISA of isoprothiolane based on mAb-DWL

2.4 抗体特异性测定

进一步对抗血清的特异性进行考察。在异原包被（稻瘟灵-OVA-2）条件下，分别以稻瘟灵、近似结构农药及相似功能农药作为抑制药物绘制icELISA的抑制曲线，结果如表2所示。可以看出，制备的单克隆抗体与所有测试药物之间的交叉反应率（CR）均低于1%，可忽略不计。说明本方法制备的抗体可特异性地识别稻瘟灵农药，适用于后续试纸条等快检产品的开发。

表2 单克隆抗体与稻瘟灵类似物的交叉反应率Table 2 The cross-reaction rates of monoclonal antibody against the analogs

2.5 实际样品检测

根据实际检测需要，选取小麦、水稻以及4种常见的蔬菜进行样品加标回收实验。根据方法检出限及GB 2763-2021对粮食及果蔬的限量标准，分别添加50．0、100．0、200．0 ng/g 3个水平的稻瘟灵标准品，混合均匀后进行提取、检测，每个样品做3个平行，结果如表3所示。基于制备的单克隆抗体建立的icELISA方法的回收率为77．2%~116%，相对标准偏差（RSD）为1．5%~7．1%，为基本满足样品的快速检测与筛查需求。

表3 6种样品中稻瘟灵的加标回收率及相对标准偏差（n=3）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of isoprothiolane in 6 samples（n=3）

3 结论

针对目前稻瘟灵免疫检测产品的缺失，本文设计并合成了稻瘟灵抗原，制备出特异性识别稻瘟灵的单克隆抗体，并基于此构建了稻瘟灵的icELISA检测方法。研究显示，在最大程度保留稻瘟灵分子特征结构的前体下，从分子的二硫杂环戊烷结构中引申出活泼手臂偶联蛋白制备的稻瘟灵抗原免疫后可产生抗体，同时，采用不同结构与静电势手臂的异原包被，可显著提升抗体与稻瘟灵的特异性识别。通过细胞融合等手段获得单克隆抗体mAb-DWL，基于该抗体建立了稻瘟灵的icELISA法，其IC50为55．2 ng/mL，线性范围为4．6~530．2 ng/mL。该方法对不同果蔬与谷物的回收率为77．2%~116%，适用于构建免疫快速检测方法实现对稻瘟灵的现场检测。