CAR-T治疗非霍奇金淋巴瘤的抵抗机制与挽救策略

颜欣 韩为东

近年来，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法已经成为多次标准治疗失败恶性血液系统肿瘤患者的新的挽救治疗方法。到目前为止，CAR-T已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗包括B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)在内的多种血液系统肿瘤。尽管CAR-T取得突破性进展，但仍有部分患者对这种治疗产生了原发或继发抵抗[1-2]。除了肿瘤外部的因素包括T细胞耗竭、T细胞长期存活减少和免疫抑制肿瘤微环境等可导致CAR-T疗法失败之外，近期越来越多的学者开始关注肿瘤细胞对于CAR-T治疗不敏感(肿瘤细胞固有抵抗)的原因。为此，我们总结了近年来CAR-T治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的肿瘤细胞固有抵抗机制并讨论相应的挽救策略。

一、靶抗原的丢失

靶抗原丢失是目前研究最广泛和明确的肿瘤细胞逃逸CAR-T治疗的机制[3]。对于DLBCL,约有1/3复发患者可出现CD19丢失或下调[3-6]。目前已报道的解释抗原阴性复发的机制包括预先存在的抗原阴性肿瘤细胞、突变或剪接变异、影响靶抗原表达的成熟/运输、表位掩蔽和谱系转换等[7]。最近，Heard等[8]在细胞和小鼠水平发现B细胞NHL(B-NHL)中高尔基体驻留的膜内蛋白酶信号肽酶样3(SPPL3)的表达是CAR-T治疗抵抗的重要调节因子。SPPL3的缺失可导致CD19糖基化过度，直接抑制CAR-T抗肿瘤细胞毒性。同时，SPPL3的过表达可能由于CD19蛋白被扣留在内质网不能到达膜表面，从而出现抗原丢失，进而导致肿瘤细胞抵抗CAR-T治疗。

在CD19阴性或低表达复发的情况下，B-NHL细胞可以保留其他B细胞的标志物，如CD22、CD20或CD70a。因此开发靶向两种或多种抗原的CAR-T可用于预防和治疗靶抗原阴性逃逸[9]。本项目组前期采用串联结构CD19-CD20双靶点CAR-T治疗87例复发难治性B-NHL，临床试验结果显示完全缓解(CR)率可达70%，同时中位无进展生存期(PFS)达27.7个月，抗原阴性复发比例仅为5.7%(5/87)[10-11]。以不依赖抗原的方式杀死肿瘤细胞或提高靶抗原的表达也有助于解决抗原阴性复发。增加CD40L组成表达的CAR-T不仅可通过直接细胞毒性杀伤CD40+肿瘤细胞，还可与抗原提呈细胞的CD40结合，从而增加抗原呈递作用，以招募更多的内源性效应细胞发挥非靶抗原依赖的T细胞受体(TCR)介导的细胞杀伤作用[12]。小分子γ分泌酶抑制剂和苔藓虫素1也在临床前研究中被发现可提高癌细胞的靶抗原表达[13-14]。

二、干扰素(IFN)-γ信号通路异常

已有相关报道缺失IFN-γ信号与黑色素瘤细胞抵抗免疫检查点抑制剂有关[15]。本项目组通过全基因组CRISPR/Cas9文库发现多种调控IFN-γ信号通路基因(包括JAK1、JAK2、STAT1、IFNGR1或IFNGR2)缺失的肿瘤细胞可逃逸CAR-T治疗[16]。除此之外，其他多个团队也发现IFN-γ信号通路异常可影响CAR-T疗效。Larson等[17]通过全基因组CRISPR/Cas9文库发现IFN-γ信号通路基因(包括IFNGR1、JAK1或JAK2)的缺失使胶质母细胞瘤和其他实体肿瘤对CAR-T的杀伤更具抵抗性。Haynes等[18]发现与野生型CAR-T相比，IFN-γ缺陷型CAR-T对结肠癌小鼠移植瘤的肿瘤控制效果较差。Arenas等[19]发现肿瘤细胞JAK2的下调可导致肿瘤细胞对靶向HER2的CAR-T产生继发性抵抗。Jain等[20]发现在DLBCL肿瘤中IFN-γ信号与包括程序性死亡配体1(PD-L1)在内的多个检查点配体的表达相关，且肿瘤患者的IFN-γ信号较高与CAR-T扩增下降相关。

增加CAR-T分泌IFN-γ可能有助于提高CAR-T疗效，Avanzi等[21]设计了分泌IL-18的TRUCKs CAR-T，其既可增加IFN-γ的分泌，还可调控肿瘤微环境中的IFN-γ信号通路，以增强内源性抗肿瘤的免疫反应。

三、凋亡信号异常

在CAR-T杀伤肿瘤细胞时，肿瘤细胞自身执行凋亡异常可导致CAR-T疗法的失败。CAR-T依赖3种途径杀死靶细胞：一种是T细胞通过分泌颗粒酶和穿孔素来触发线粒体参与的内源性凋亡通路[22]；另一种是死亡受体启动的外源性凋亡通路，又称为死亡受体凋亡通路；此外还有细胞因子依赖途径[23]。

为了系统地发现肿瘤细胞抵抗CAR-T治疗的肿瘤固有因素，近期本项目组通过全基因组CRISPR/Cas9文库筛选技术，以人B淋巴白血病细胞(Nalm6)为模型，进行低效靶比、长时间的Nalm6细胞与CD19 CAR-T共培养，挖掘参与B-NHL抵抗CAR-T治疗的关键功能基因[16]。我们发现肿瘤细胞NOXA基因缺失可导致肿瘤细胞逃逸CAR-T疗法。NOXA蛋白被称为诱导细胞凋亡的增敏剂，是一种促细胞凋亡的B淋巴细胞瘤(BCL)-2家族蛋白[24]。本项目组在体内和体外水平发现B-NHL中NOXA缺失可阻碍CAR-T诱导靶细胞发生内源性凋亡，从而导致肿瘤细胞抵抗CAR-T治疗[16]。回顾性分析结果提示，NOXA在约38%的NHL患者肿瘤中表达缺失或低下[免疫组织化学(IHC)评分<4分]，约70%NOXA低表达的NHL患者在6个月内发生疾病进展，而仅有15%NOXA高表达患者在6个月内发生疾病进展[16]。更重要的是，本项目组在细胞及动物水平也发现组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂可上调肿瘤细胞NOXA的蛋白水平，从而逆转患者对CAR-T治疗的抵抗。这一研究成果提示NHL患者肿瘤样本的NOXA表达可用于预测CAR-T疗效并对患者分层治疗，NOXA低表达患者可尝试HDAC抑制剂联合CAR-T疗法。

在CAR-T接触靶细胞后，CAR参与诱导Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)表达的上调，使CAR-T能够利用死亡受体途径以抗原依赖性和非依赖性的方式杀死肿瘤细胞。Upadhyay等[25]在细胞及动物水平发现使用抗FasL抗体或Fas缺陷靶细胞来破坏死亡受体途径后可导致CAR-T引发的肿瘤细胞抗原依赖性凋亡和非抗原依赖性的旁观者凋亡减少；同时还发现，在ZUMA-1临床试验中，肿瘤样本Fas高表达的NHL患者在输注CAR-T后经历了更持久的临床应答和更长的生存时间；更重要的是，他们发现凋亡抑制因子(IAP)和抗凋亡髓系细胞白血病1(MCL1)蛋白的抑制剂可提高靶细胞和旁观者肿瘤细胞对CAR-T介导的Fas依赖性杀伤的敏感性，可作为联合CAR-T疗法的候选药物。

Singh等[26]通过CRISPR文库筛选发现死亡受体凋亡通路受损是B-ALL患者原发抵抗CAR-T疗法的新机制。在体外实验通过CRISPR/Cas9技术敲除肿瘤细胞促凋亡基因FADD、BID、CASP8和TNFRSF10B后，肿瘤细胞可抵抗CAR-T杀伤。相反，敲除抗凋亡基因(如CFLAR、TRAF2和BIRC2)可提高肿瘤细胞对CAR-T杀伤的敏感性。他们发现在靶抗原持续存在时，死亡受体信号受损的肿瘤细胞可导致CAR-T发生进展性功能障碍。通过对两项临床试验中CAR-T治疗B-ALL患者骨髓标本的转录组学分析发现，死亡受体信号评分下降患者体内CAR-T扩增减少，输注CAR-T后总生存期(OS)缩短。Dufva等[27]通过对高通量药物筛选和全基因组CRISPR文库筛选也发现FADD和TNFRSF10B缺失可导致肿瘤细胞抵抗CAR-T疗法，同时还发现IAP抑制剂(birinapant，AT-406和LCL-161)可显著增强CAR-T毒性。

TP53基因改变是复发难治性侵袭性B-NHL患者预后不佳的因素之一[28]。Shouval等[29]通过对输注CAR-T患者的肿瘤组织进行靶向二代测序，发现37%的B-NHL患者可发生TP53异常[突变和(或)拷贝数改变]，同时TP53异常与较低的CR、OS率相关。TP53异常患者1年OS率为44%，远低于野生型患者(76%)。TP53异常导致肿瘤细胞抵抗CAR-T治疗机制可能与IFN-γ信号和凋亡信号通路受损及浸润的CAR-T减少有关。最近，Wei等[30]研究发现抗CD19和抗CD22 CAR(CAR19/22) T细胞鸡尾酒疗法对于TP53异常复发难治性B-NHL有效，同时将CAR-T治疗与自体干细胞移植相结合可进一步改善这些患者的长期预后，最佳客观缓解率(ORR)可达92.9%，2年PFS和OS率分别为77.5%和89.3%。

四、黏附分子表达异常

最近，本项目组通过全基因组CRISPR/Cas9文库筛选发现B-NHL细胞CD81和CD58的缺失可介导肿瘤细胞逃逸CAR-T治疗[31]。CD81的缺失可阻止CD19成熟和运输至细胞膜上，已被证实是抵抗靶向CD19治疗的机制之一[32]。CD58是人类T细胞CD2分子的配体，在天然细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)中，CD58与CD2的相互作用可促进T细胞和抗原提呈细胞之间形成免疫突触，增强TCR与主要组织相容性复合体(MHC)抗原肽的结合，为T细胞增殖、细胞因子的产生和激活提供了必要的共刺激信号[33]。

本项目组观察到两种B-NHL细胞系的CD58缺失对多种CAR-T治疗产生抵抗。此外，我们还发现肿瘤细胞中CD58缺失导致其与CAR-T接触不良，形成受损的免疫突触，CAR信号激活减弱，从而导致CAR-T功能障碍，主要表现为CAR-T增殖减慢、脱颗粒减少、细胞因子分泌减少、细胞不良反应降低及CAR-T死亡增多等。最近，Romain等[34]和Majzner等[35]均发现在接受CD19 CAR-T治疗的复发难治性B-NHL患者中，治疗前肿瘤样本中CD58高表达患者显示出对CAR-T治疗的高CR率和高生存率。B-NHL患者CD58的基因突变具有种族差异影响，在西方国家的B-NHL患者中，CD58基因的遗传缺失率约为20%，蛋白表达下降的发生率约为67%[36]；然而我国B-NHL患者CD58基因突变率仅约5%～10%[37-38]，远低于西方人群。

Majzner等[35]提出CD58-CD2相互作用的受损可通过整合CD2共刺激结构域的二代CAR-T进行挽救，然而这种新型CAR-T仅在细胞实验和小鼠实验中表现出增强的疗效，尚未在患者中测试。CD58的表达可受遗传和表观调控[36]，选择合适的表观遗传调节剂提高CD58的表达可能有助于逆转CAR-T治疗抵抗。

五、抑制性配体的表达

抑制性配体PD-L1和PD-L2可由肿瘤细胞或肿瘤微环境中其他细胞表达，这些配体在与其受体[即程序性死亡受体1(PD-1)]结合时可阻止CAR-T活化，从而导致免疫逃逸。Neelapu等[39]发现在ZUMA-1试验中，Axi-Cel治疗后21例B-NHL患者出现疾病进展，其中13例表达PD-L1，提示B-NHL患者PD-L1高表达可作为CAR-T疗效差的预测标志物。近期，本项目组分析了5例复发难治性B-NHL患者在CAR-T输注后复发或进展后给予抗PD-1治疗，其中3例出现应答[2例CR,1例部分缓解(PR)],2例患者出现疾病进展。肿瘤标本免疫组织化学检测显示，PD-1/PD-L1在抗PD-1治疗有应答反应患者中的表达水平高于无应答反应患者。因此，本项目组提出，对于CAR-T治疗失败后复发难治性B-NHL患者，如果肿瘤细胞表达PD-L1，肿瘤浸润性T细胞中PD-1水平较高，则释放对免疫检查点的抑制可能有助于增效CAR-T治疗[40]。

六、总结

发现肿瘤细胞抵抗CAR-T治疗的机制对于开发提高CAR-T疗效的策略具有关键的指导意义。靶抗原的丢失是研究最广泛的CAR-T治疗抵抗机制，现在已开发包括多靶点抗原的CAR-T来克服和预防由于靶抗原的丢失带来的治疗抵抗问题。最近，肿瘤细胞逃逸CAR-T杀伤的其他机制，如IFN-γ信号通路异常、凋亡信号的异常、黏附分子的缺失及抑制性配体的表达增高也逐渐被发现，尽管针对这些新发现的抵抗机制都有相应的策略进行规避，但这些策略大多数都处于临床前阶段，仍需要应用于更多的患者并进行评价。最后，随着CAR-T广泛的商品化应用，发现患者对于CAR-T的抵抗机制有助于精准预测CAR-T疗效并设计合适的产品提高其疗效。