3 种锌源对断奶仔猪生长性能、腹泻率、肠黏膜形态及肠道菌群多样性的影响

2022-11-17周金柱李二伟黄世猛李运川刘秀娟孟灵彪吕家煌

中国畜牧杂志 2022年11期

郭彤，周金柱，李二伟，黄世猛，李运川，刘秀娟，孟灵彪，顾俊，吕家煌，李彬

（1.北京农业职业学院畜牧兽医系，北京 102442；2.江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京 210014；3.北京桃古图新材料有限公司，北京 100025）

预防和降低断奶仔猪应激产生的腹泻是养殖生产研究的热点[1-2]。研究表明，饲粮中添加高剂量氧化锌能有效降低仔猪早期断奶带来的应激[3]。但长期添加高剂量氧化锌会导致资源浪费、环境污染，甚至对人类健康产生严重危害[4]。因此，降低日粮中锌的添加量、寻找安全环保的锌替代品成为亟待解决的问题。

纳米氧化锌具有颗粒小、比表面积大、吸附率高等特点，可提高锌的生物利用率，降低氧化锌的使用量，在猪、鸡上已有研究报道[5-6]。由于纳米氧化锌能渗入到细胞和组织内，使细胞坏死和组织发生病变[7]，其对动物可能有毒害作用[8-9]。蒙脱石能吸附肠道致病菌、病毒及其产生的毒素并将其固定，随粪便排出体外[10]，在治疗畜禽腹泻性疾病、保护肠黏膜方面具有良好的疗效[11-13]，且绿色环保、无耐药性、无毒副作用，已被广泛应用于畜禽养殖生产中[14]。蒙脱石本身无抑菌或杀菌作用，但载入金属离子（Ag+、Cu2+、Zn2+）或金属氧化物（TiO2、ZnO）后，具有了强大的杀菌作用[15]，能将动物肠道有害菌杀灭，起到类似抗生素的作用。

本试验将纳米氧化锌负载在蒙脱石上制备出新型改性蒙脱石——蒙脱石负载型氧化锌，旨在研究普通氧化锌、纳米氧化锌和蒙脱石负载型氧化锌对断奶仔猪生长性能、腹泻率、肠黏膜形态及肠道菌群多样性的影响，为蒙脱石负载型氧化锌在断奶仔猪生产中的应用提供科学依据，为高锌饲粮替代品的研发提供理论和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料普通氧化锌（饲料级，锌含量≥76.3%）由石家庄百胜化工有限公司提供；纳米氧化锌（饲料级，锌含量≥77%）由济源鲁泰纳米材料有限公司提供；蒙脱石负载型氧化锌（饲料级，锌含量≥30%）由北京桃古图新材料有限公司提供。

1.2 试验设计与试验日粮选择144 头体重（7.0±0.2）kg的杜× 长× 大三元杂交仔猪，按胎次一致、体重相近原则，采用随机区组设计分为4 组，每组6 个重复，每个重复6 头（公母各半）。对照组饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加3 000 mg/kg 普通氧化锌、1 500 mg/kg 纳米氧化锌、600 mg/kg 蒙脱石负载型氧化锌（均以锌计）。预试期7 d，试验期14 d。基础日粮参照NRC（2012）断奶仔猪营养需要配制成粉状全价料，基础日粮组成及营养成分见表1。

表1 基础日粮组成和营养成分（风干基础）

1.3 饲养管理饲养试验于2021 年4 月—2021 年5 月在如皋博益牧业有限公司进行。猪场具有规模化生产设备，防疫和饲养管理科学规范，完全满足试验要求。仔猪在保育床上饲养，自由采食和饮水，按时清理卫生，从7 日龄开始诱食并哺乳至21 日龄断奶，按常规程序对仔猪进行免疫和定期消毒。

1.4 样品采集与保存饲养试验结束称重后，从各组中随机选取体重接近平均体重的试验猪各12 头（每个重复2 头，公母各半），继续饲喂0.5 h，仔猪采食2 h 后屠宰。各组断奶仔猪屠宰后无菌操作取出回肠和结肠内容物各约2 g，消毒结扎后其中1 g 放入消毒容器中，4℃立即运回无菌操作室，无菌超净台内将肠道内容物充分与生理盐水混合，对其所含微生物（如大肠杆菌、沙门氏菌）数量进行检测。另外1 g 放入5 mL 冻存管并迅速置于液氮中，用于肠道菌群多样性分析。

屠宰后，分别在各断奶仔猪十二指肠、空肠、回肠相同部位取长度约1～2 cm 的肠道组织，切开小肠于相同位置分别取0.5 cm×0.5 cm 的组织，用生理盐水清洗干净后，置于10%甲醛溶液中固定，4℃保存，用于光镜分析其形态结构的变化。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 生长性能及腹泻率试验期间每天精确记录采食量和腹泻状况。试验结束后，禁食12 h（自由饮水）后称重，按每个重复计算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）、耗料增重比（F/G）。每天定时记录仔猪腹泻情况，于试验结束后计算每个处理组的腹泻率。计算公式：

腹泻率=（腹泻头数× 腹泻天数）/（试验头数×试验天数）×100%

1.5.2 肠道内锌含量称取0.2 g 左右肠道内容物，将样品分别加入洗净的聚四氟乙烯消解管中，并用移液枪加入5 mL 65% HNO3和2 mL HF。之后密闭并按微波消解仪（CEM-MARS6，美国）的相应要求及消解程序进行消解。消解后，待消解液冷却到60℃以下，取出消解罐，将消解液置于50 mL 容量瓶中，用少量超纯水清洗消解管3 次，清洗液倒入容量瓶中，用超纯水定容、摇匀，取适量用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，赛默飞世尔科技有限公司）检测锌含量。

1.5.3 肠黏膜形态用Leica 组织切片机将肠段样品经固定、修整、冲洗、脱水、切片（厚度约5 μm）和苏木精-伊红（HE）染色制成切片，每个样品制作3 个非连续性的纵切片和横切片。用 Leica Qwin 图像分析仪对绒毛高度、隐窝深度进行显微测量和分析，每张纵切片测定10 个绒毛高度和隐窝深度，取其平均值作为1 个测定数据，并计算绒毛高度/隐窝深度。

1.5.4 肠道菌群在无菌工作台中将取出的回肠和结肠内容物各取0.5 g 放入无菌试管中，并加入4.5 mL 无菌稀释液，在磁力震荡器上震荡3～5 min，记此液为10-1稀释液；随后吸取0.5 mL 稀释液（10-1）加入到含有4.5 mL无菌稀释液的无菌试管中，震荡后记为10-2稀释液，再依次进行10-3到10-6倍稀释。分别将不同肠段、不同稀释度的稀释液涂布在各培养基上，采用平板计数法进行菌落计数，用每克肠道内容物中细菌个数的对数（Log10CFU/g）表示。每个稀释度均设3 个重复。检测致病菌大肠杆菌、沙门氏菌的数量。根据菌群和细胞形态、革兰氏染色、耗氧性来鉴定细菌种类。

1.5.5 肠道菌群多样性将样品送至上海派森诺生物技术公司，使用高通量测序技术对回肠和结肠内容物进行16S rRNA 基因测序。

1.6 统计分析所有的数据采用SPSS 22.0 进行方差分析，采用Duncan's 多重检验分析组间差异，以P＜0.05 作为差异显著性判断标准，结果均以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 不同锌源对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响由表2 可知，普通氧化锌组、纳米氧化锌组和蒙脱石负载型氧化锌组断奶仔猪平均日增重较对照组分别提高了19.2%、38.5% 和65.9%（P＜0.05）；耗料增重比较对照组分别降低了17.1%、26.7% 和32.7%（P＜0.05）；腹泻率分别降低了54.4%、62.5%和87.4%（P＜0.05）。

表2 不同锌源对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响（n=6）

2.2 不同锌源对断奶仔猪回肠食糜中锌含量的影响由图1 可见，普通氧化锌组、纳米氧化锌组和蒙脱石负载型氧化锌组仔猪回肠食糜中锌含量较对照组分别提高了16.87%、72.37%和83.97%（P＜0.05）。蒙脱石负载型氧化锌组仔猪回肠食糜中锌含量最高，高达2 713 mg/kg，高于纳米氧化锌组和普通氧化锌组（P＜0.05）。

图1 不同锌源对断奶仔猪回肠食糜锌含量的影响（n=6）

2.3 不同锌源对断奶仔猪肠道常见致病菌数量的影响由表3 可见，与对照组相比，蒙脱石负载型氧化锌组断奶仔猪回肠和结肠中大肠杆菌和沙门氏菌的数量分别降低了100%、100% 和77.8%、100%（P＜0.05）；与纳米氧化锌组和普通氧化锌组相比，蒙脱石负载型氧化锌组回肠中大肠杆菌和沙门氏菌的数量均降低了100%（P＜0.05），结肠中大肠杆菌和沙门氏菌的数量分别降低了52.7%、68.8%和100%、100%（P＜0.05）。

表3 不同锌源对断奶仔猪肠道中常见致病菌数量的影响（n=6） log10 CFU/g

2.4 不同锌源对断奶仔猪肠黏膜形态的影响由表4 可知，与对照组相比，蒙脱石负载型氧化锌组十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度分别提高了36.8%、43.5% 和61.9%（P＜0.05）；十二指肠、空肠和回肠绒毛高度/隐窝深度分别提高了92.5%、90.0%和91.4%（P＜0.05），且优于普通氧化锌组和纳米氧化锌组（P＜0.05）。

表4 不同锌源对断奶仔猪肠道绒毛高度和隐窝深度的影响（n=6）

2.5 不同锌源对断奶仔猪肠道菌群多样性的影响由图2A 可知，在门水平上，仔猪回肠内容物菌群主要由厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）等组成，各组均以厚壁菌门丰度最高，普通氧化锌组和纳米氧化锌组放线菌门丰度也较高。由图2B 可知，仔猪结肠内容物菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门和变形菌门等组成，各组中厚壁菌门丰度最高。可见，不同锌源对仔猪肠道内容物在门水平上的组成差异不显著，优势菌群均是厚壁菌门，占比超过90%。

由图2C 可知，在属水平上，对照组仔猪回肠以梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）为主要优势菌群，而在试验组仔猪回肠的优势菌群是乳杆菌属（Lactobacillus）和链球菌属（Streptococcus）。其中，蒙脱石负载型氧化锌组中优势菌群为乳杆菌属，占菌群总丰度80% 以上，远高于对照组、普通氧化锌组和纳米氧化锌组。4 个组仔猪的结肠微生物菌群差异不显著，主要优势菌群为乳杆菌属（Lactobacillus）（图2D）。

图2 不同锌源对断奶仔猪肠道菌群的影响（n=6）

3 讨论

3.1 不同锌源对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响断奶仔猪早期因肠道发育尚未成熟，对由母乳转变为固体饲料的消化吸收能力差，易导致腹泻，生产性能降低。氧化锌是防止腹泻常用的饲料添加剂。大量研究表明，高剂量氧化锌能促进仔猪生长，减少腹泻率，但由于其生物利用率低，会造成锌源浪费和对环境产生污染而被禁用[16]。纳米氧化锌具有粒径小、比表面积高和高化学活性等特点，可提高对肠黏膜的吸附性和停留时间，从而提高锌的生物利用率[17]。但近年来发现，纳米氧化锌对动物可能存在一定的毒性作用[18]。本试验结果表明，断奶仔猪日粮中添加1 500 mg/kg 纳米氧化锌提高仔猪平均日增重和降低腹泻率的效果优于3 000 mg/kg普通氧化锌，并未发现仔猪表观上出现异常；日粮中添加600 mg/kg 蒙脱石负载型氧化锌在提高仔猪平均日增重和降低腹泻率方面显著优于3 000 mg/kg 普通氧化锌和1 500 mg/kg 纳米氧化锌。王彬等[19]研究也表明，饲粮中添加纳米氧化锌可显著提高断奶仔猪平均日采食量和平均日增重，降低耗料增重比和腹泻率。刘汉锁等[3]研究表明，与普通氧化锌相比，饲粮中添加1 600 mg/kg纳米氧化锌可显著降低断奶仔猪腹泻率。究其原因可能是由于蒙脱石具有强大的吸附和缓释、控释特性，氧化锌具有强大的杀菌作用，蒙脱石负载纳米氧化锌后增强了纳米氧化锌与细菌的亲和力，使其通过抑制细菌电子传递链中酶活性的方式达到抗菌目的[20]。同时，蒙脱石负载的纳米氧化锌微粒可在仔猪肠道缓慢释放，增加微粒与肠壁的接触面积，延长接触时间，使纳米氧化锌的生物利用率大大提高，因而促进了仔猪生长并降低了腹泻率[14]。本研究结果提示，日粮中添加600 mg/kg蒙脱石负载纳米氧化锌既能降低锌的添加量、减轻高锌给环境带来的压力，又能促进仔猪生长、降低腹泻率，且无毒无害，是高锌日粮理想的替代品。

3.2 不同锌源对断奶仔猪回肠食糜中锌含量的影响肠道是动物生长的重要保障，是防止病原菌入侵的第一道防线。肠道的健康主要与其免疫功能有关。锌对动物机体生长发育、免疫功能和肠道健康等方面均具有重要的调节作用[21]。肠道食糜锌含量与其生物利用率关系密切。Davin 等[22]研究表明，在断奶仔猪日粮中添加高剂量氧化锌，回肠、结肠食糜中锌含量显著增加。刘汉锁等[3]研究表明，纳米氧化锌组断奶仔猪盲肠和结肠

食糜中锌含量与对照组无显著差异。而本试验结果表明，纳米氧化锌在回肠食糜中的锌含量显著高于对照组。可能是纳米氧化锌微粒粒径小，增加了与断奶仔猪肠壁的接触时间和面积，延长了与肠道黏膜的作用时间[25]，使其在回肠食糜中锌含量显著高于对照组。本试验结果表明，蒙脱石负载纳米氧化锌组断奶仔猪回肠食糜中锌含量显著高于普通氧化锌组和纳米氧化锌组，可能与蒙脱石作为载体有关。首先，断奶仔猪采食蒙脱石负载纳米氧化锌的饲粮进入胃之后减少了胃酸对氧化锌的破坏，提高了其耐酸性，使其到达肠道的有效成分多于普通氧化锌和纳米氧化锌[23]。其次，蒙脱石硅氧四面体片中的硅离子和铝氧八面体片中的铝离子在晶体形成中常被低价的阳离子同晶替代，使晶体带有大量负电荷，为平衡负电荷使晶体保持中性，层间会吸附可交换的阳离子，使得蒙脱石具有强大的静电吸附能力。通过静电结合，蒙脱石吸附于消化道黏膜并与消化道黏液蛋白结合，提高了消化道黏液的分泌量，并增加其在肠道中的停留时间[14]；同时蒙脱石具有一定缓释作用，可使层间纳米氧化锌缓慢释放，两者协同作用，最终提高了其在肠道中的浓度[24]。

3.3 不同锌源对断奶仔猪肠道常见致病菌数量的影响病原微生物的感染和继发性感染会加剧断奶仔猪腹泻的发病率和致死率。研究表明，高剂量氧化锌可降低小肠的细菌移位[26]，提高肠道菌群的稳定性和均匀性。Hu等[27]研究表明，断奶仔猪饲粮中添加2 000 mg/kg 氧化锌降低了回肠中梭状芽孢杆菌的数量，但对大肠杆菌无影响，而添加500 mg/kg 载锌蒙脱石可降低断奶仔猪肠道梭状芽孢杆菌和大肠杆菌的数量。本试验结果表明，添加蒙脱石负载纳米氧化锌可杀灭回肠和结肠中的大肠杆菌和沙门氏菌，其杀菌效果明显优于普通氧化锌和纳米氧化锌，其原因主要是由于蒙脱石本身有强大的吸附细菌的能力，氧化锌有杀菌作用，氧化锌载入蒙脱石后，使蒙脱石失去了电子平衡后带有过剩的正电荷，而大肠杆菌和沙门氏菌在生理pH 条件下呈负电荷[26]。通过静电吸引，细菌被吸附到蒙脱石负载纳米氧化锌上，使富集在蒙脱石表面的氧化锌直接杀灭细菌[24]。这也是蒙脱石负载纳米氧化锌能显著降低早期断奶仔猪腹泻率的原因之一。

3.4 不同锌源对断奶仔猪肠黏膜形态的影响锌作为肠道上皮细胞发育成熟的必需微量元素，有利于改善肠道形态，增加蛋白质合成和肠道细胞增殖[28]。机体对营养物质的吸收主要在小肠，吸收能力的高低与小肠的绒毛高度、隐窝深度以及两者的比值有关。小肠绒毛越高，肠道上皮细胞越多，肠道的吸收能力越强。隐窝深度可反映肠上皮细胞的形成速率。隐窝深度越浅，表明成熟细胞向上移动速率越高。而绒毛高度/隐窝深度值则可综合反映肠道的功能状况。Wang 等[5]研究表明，添加纳米氧化锌可改善断奶仔猪肠道形态，增加十二指肠和回肠绒毛长度和绒毛表面积，降低隐窝深度。Hu 等[27]研究表明，断奶仔猪饲粮中添加500 mg/kg 载锌蒙脱石和2 000 mg/kg 氧化锌使空肠黏膜绒毛高度和绒毛高度/ 隐窝深度值显著增加。本试验结果也表明，3 种锌源饲料对肠黏膜形态均有改善作用，且蒙脱石负载纳米氧化锌组断奶仔猪十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度值显著优于普通氧化锌组和纳米氧化锌组。分析其原因，一方面是由于蒙脱石本身可在消化道内形成一层保护膜，对各种病毒、细菌及所产生的毒素等有良好的吸附能力，阻止病原菌对肠上皮细胞的侵入，从而保护肠黏膜[24]；另一方面，蒙脱石负载纳米氧化锌能显著降低肠道内大肠杆菌和沙门氏菌的数量，且氧化锌可以在肠道内持续缓释，从而保护了肠黏膜形态结构的完整性。此外，蒙脱石能够与肠道黏液蛋白静电结合，增加黏膜厚度，促进肠上皮细胞增殖和黏液分泌，增加黏液量，改善黏液质量[14]，从而对消化道黏膜起保护和修复作用，促进肠道发育。

3.5 不同锌源对断奶仔猪肠道微生物多样性的影响在正常情况下，仔猪肠道内的有害菌群和有益菌群相互制约、相互依赖，以维持肠道菌群动态平衡。仔猪断奶产生应激会造成肠道菌群失调[29]，导致仔猪腹泻、饲料转化率下降。焦乐飞[15]研究表明，在门水平上，添加2 g/kg 载铜/锌蒙脱石显著提高了断奶仔猪结肠厚壁菌门相对丰度，降低了拟杆菌门和变形菌门相对丰度；在属水平上，显著提高了乳杆菌属、双歧杆菌属和优杆菌属等有益菌属相对丰度，显著降低了梭菌属和链球菌属等有害菌属相对丰度。本试验结果表明，在门水平上，3 种锌源组回肠和结肠中均以厚壁菌门相对丰度较高；在属水平上，3 种锌源组优势细菌种属为乳杆菌属、双歧杆菌属，大大降低了回肠和结肠中梭菌属和链球菌属的相对丰度。饲粮中添加蒙脱石负载纳米氧化锌能够有效降低仔猪回肠和结肠中梭菌属和链球菌属等致病菌的丰度，显著提高优势菌群——乳杆菌属的丰度，分析其原因可能与形成蒙脱石-有益菌生物膜有关。双歧杆菌和乳酸杆菌可通过代谢产生乳酸，乳酸在蒙脱石和益生菌之间形成酸性微环境，使细菌表面上带负电的磷酸被蒙脱石表面的阳离子吸引，促进细菌聚集而形成蒙脱石-有益菌生物膜[15]，减少益生菌受肠道内消化酶、胆盐等破坏，进而利于有益菌繁殖。综上，蒙脱石负载纳米氧化锌在一定程度上具有优化和平衡肠道菌群结构、增强肠道菌群稳定性、保护肠黏膜形态完整性、降低仔猪腹泻、促进仔猪生长的作用。