支气管哮喘患儿外周血miR-123-P13K/AKT信号通路的表达及临床意义*

徐甘霖，王文亮

深圳市儿童医院中医科，广东 深圳 518000

支气管哮喘（简称哮喘）是由多因素引发，以气道高 反应性和气道慢性炎症为特异性表现的呼吸系统疾病，好发于儿童群体。流行病学研究发现，儿童哮喘发病率随环境的恶化逐年上升［1］。气道慢性炎症反应引发的气道结构重塑，进而使得气道发生气流阻塞被认为是哮喘发生的重要病理过程［2］。磷脂酰肌醇3 激酶（P13K）蛋白激酶B（AKT）信号通路是参与调控机体细胞增值、凋亡的重要信号通路，P13K/AKT在哮喘气道重塑病理发展中的作用已逐渐被证实，然而其具体调控机制仍尚未明确［3］。近来发现［4］，miRNA的表达与气道变应性炎症的发生密切相关，且与健康儿童比较，哮喘患儿外周血miRNA 水平明显不同。miR-123 是最新发现的miRNA，可通过参与调控相关信号通路的表达，以促进下游靶蛋白的表达，进而促进肿瘤细胞的恶性增值、侵袭［5］。然而其是否可通过调控P13K/AKT信号通路的表达进而促进哮喘患儿病情的发展仍尚未见系统报道。基于此背景，本研究以支气管哮喘患儿为研究对象，探讨miR-123 的表达变化与其病情的关系，旨在明确miR-123 对哮喘患儿病情的预测价值，以期为后续临床早期的预测评估及靶向治疗提供新思路，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月—2020年12月深圳市儿童医院收治的支气管哮喘患儿50 例（研究组），同期选择体检健康儿童50例（对照组）。纳入标准：符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年）》相关诊断标准［6］。无严重先天性疾病，如先天性心脏病等。年龄4～12岁。无活动期急慢性肺部疾病。患儿家属自愿签署知情同意书。排除标准：合并真菌感染等传染性呼吸道疾病。合并先天性气道疾病。合并免疫系统重症疾病。心、肝、肾脏功能异常及重症疾病。本研究经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 血清指标检测 研究组入院后次日采用EDTA 抗凝管（济南千司生物技术有限公司）采集空腹（8 h）外周静脉血5 mL，采血时患儿均处于发病急性期，同期采集对照组受试者5 mL空腹外周静脉血。随后分离出外周血单个核细胞，引物设计参考王重植［7］。随后滴入1 mL TRLzol（广州济恒医药科技有限公司），提取总RNA，试剂盒购置于：上海双赢生物科技有限公司。miR-123、P13K、AKT mRNA 的表达严格按照试剂盒说明进行。采用酶联免疫吸附法检测两组受试者白细胞介素4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）表达情况，试剂盒购置于上海机纯实业有限公司。

1.2.2 两组受试者肺功能检查 采用肺功能检查仪进行肺功能相关指标检查，包括呼气峰流量（PEF）、第1 秒用力呼气量（FEV1）和肺活量（VC），仪器购置于济南欧莱博科学仪器有限公司。

1.3 观察指标

比较两组受试者外周血miR-123、P13K、AKTmRNA表达、IL-4和IFN及肺功能情况。采用Pearson相关系数进行相关性检验。采用多元线性回归及logistics回归模型进行回归分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者一般资料情况

两组受试者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组受试者一般资料情况（±s） 例（%）

表1 两组受试者一般资料情况（±s） 例（%）

维度性别（images/BZ_30_1428_385_1450_428.png±s，男/女）年龄（images/BZ_30_1428_385_1450_428.png±s，岁）对照组（n=50）75/25 6.78±1.27研究组（n=20）88/32 6.57±1.31 t/χ2值0.08 1.23 P值0.78 0.22

2.2 两组受试者外周血miR-123、P13K、AKTmRNA 表达、血清IL-4和IFN-γ及肺功能情况

研究组miR-123、P13K、AKT mRNA、IL-4 均显著高于对照组，而IFN-γ、PEF、FEV1 和VC 均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组受试者外周血miR-123、P13K、AKTmRNA表达、血清IL-4和IFN-γ及肺功能情况（±s）

表2 两组受试者外周血miR-123、P13K、AKTmRNA表达、血清IL-4和IFN-γ及肺功能情况（±s）

组别研究组（n=50）对照组（n=50）t值P值组别研究组（n=50）对照组（n=50）t值P值miR-123 mRNA 2.71±0.65 1.21±0.31 22.41 0 IFN-γ（ng/mL）49.67±13.22 86.71 ±15.71 18.7 0 PI3K mRNA 2.57±0.57 1.32±0.27 21.32 0 IL-4（ng/mL）176.72±12.15 76.75 ±16.21 50.89 0 AKT mRNA 2.67±0.43 1.37±0.22 28.89 0 FEV1（mL）520.34±96.75 967.63±32.47 47.53 0 PEF（L/s）2.17±0.48 3.81±0.72 19.45 0 VC（L）2.30±0.41 3.52±0.62 16.85 0

2.3 miR-123 mRNA表达的相关性分析

miR-123 mRNA 的表达与P13K、AKT、IL-4呈显著正相关，差异有统计学意义（P＜0.05），与IFN-γ、PEF、FEV1和VC呈显著负相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 miR-123 mRNA表达的相关性分析结果

2.4 miR-123 mRNA表达的多元线性回归分析结果

以miR-123 mRNA 的表达为因变量纳入多元线性回归模型，结果发现，P13K、AKT、IL-4、IFN-γ、PEF、FEV1 和VC 为影响其表达的独立危险因素，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 miR-123 mRNA表达的多元线性回归分析结果

2.5 支气管哮喘发病的logistics回归分析结果

以支气管哮喘患儿病情为因变量纳入logistics 回归模型，单因素分析结果显示，miR-123、IFN-γ、IL-4、AKT、P13K和肺功能为影响患儿病情的危险因素、多因素结果显示，miR-123、IFN-γ、IL-4、AKT、P13K和肺功能为独立危险因素，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 支气管哮喘发病的logistics回归分析结果

3 讨论

气道重塑是机体受损的修复机制，由中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和气道上皮细胞等参与发生，其特征表现为平滑肌增生肥大、上皮下纤维化和上皮脱离等［8］。近来研究证实［9］，非致死性哮喘气道壁厚度显著低于致命性哮喘患者。炎症因子的过度表达是这一过程发生、发展的重要诱因之一，而T 细胞（Th）的过度活化和增值与气道慢性炎症的持续激活密切相关。IFN-γ、IL-4 分别由Th1 和Th2 分泌，Th1 通过分泌IFN-γ 对Th2 性细胞因子IL-4 发挥拮抗作用，以维持机体Th1/Th2 平衡［10］。然而顾红丹等［11］证实，哮喘患儿Th1/Th2 平衡显著失衡，且IFN-γ 的表达明显降低，而IL-4 的表达明显上调。本次实验亦发现，与对照组儿童相比，研究组患儿血清IL-4表达明显更高，而IFN-γ的表达明显更低，表明T细胞的表达紊乱在哮喘发生的基础病理中扮演着尤为重要的角色。故进一步探讨并明确哮喘患儿T细胞紊乱表达的具体调控机制，对疾病的早期评估预防和靶向治疗均意义重大。

P13K是酪氮酸相关激酶，涉及细胞从生长到凋亡的广泛反应，与早期T 细胞活化密切相关［12］。研究证实［13］，P13K是激活CD3+活化Th2细胞表达的关键上游分子，其具有三类，其中I类又可分为a和b两种亚型。p110催化亚基和p85调节亚基在正常机体中通过相互作用以抑制P13K的表达活性，当上游信号被激活，如感染、炎症和细胞因子等刺激，二者相互作用被解除致使P13K活化表达。重要的是在这一过程中，ART 作为调控细胞凋亡和存活的重要因子亦被磷酸化和募集，并通过介导下游炎症因子的表达促进炎症反应的进一步活化激活［14］。潘凌宇等［15］报道提示，P13K/PKB信号通路的异常激活是导致哮喘发生、发展的重要病理环节。常兴等［16］报道显示，P13K 信号通路的异常激活与支气管哮喘的发病密切相关，并且报道指出，以P13K信号通路的相关调控机制作为靶点进行靶向药物的研究对哮喘的早期治疗十分重要。刘楠等［17］证实，和厚朴酚可通过抑制P13K/ART 信号通路的表达，进而抑制OVA 致哮喘小鼠的气道炎症反应。本次实验结果显示，研究组患儿外周血P13K和Akt mRNA表达均显著高于对照组，提示在支气管哮喘患儿病发的基础病理环节中P13K/ART信号通路的异常激活发挥着重要作用。考虑慢性炎症的持续激活被证实是导致哮喘发生的重要病理机制，而上游P13K/ART信号通路作为T细胞活化的重要调节信号，其信号被异常激活可引发下游炎症因子的表达上调。值得一提的是，近年来多项研究证实，在哮喘患儿痰液中存在明显的miRNA异常表达。吴媛媛等［18］证实，miRNA的差异化表达可为哮喘小鼠的治疗通过新靶点。黄青华等［19］研究证实，miRNA-19a可通过靶向调节P13K/ART的表达从而促进哮喘大鼠的病情发展。本次实验结果显示，研究组患儿外周血mi-123 mRNA 表达水平显著高于对照组，证实miR-123 mRNA 的异常激活可能是哮喘患儿病发的新靶点。Pearson相关性分析发现，哮喘患儿外周血miR-123 的表达与P13K、AKT、IL-4、IFN-γ、PEF、FEV1 和VC 显著相关，提示miR-123可能通过靶向调控P13K/Akt 信号通路的表达进而对下游T细胞因子的分泌产生影响，进而促进患儿肺功能降低。多元线性回归分析发现，P13K、AKT、IL-4、IFN-γ、PEF、FEV1 和VC 的改变是影响miR-123 表达的独立危险因素，考虑哮喘患儿肺功能的持续恶化与慢性炎症的持续激活和炎症水平的上升密切相关，而IL-4 和IFN-γ 是T 细胞重要的细胞因子可反映机体T细胞活化状态和炎症反应水平，而P13K/AKT 信号通路是调控IL-4和IFN-γ的重要上游信号，前者的表达异常有效促进了IL-4和IFN-γ的活化表达，而miR-123 似乎在这一反应中扮演了始动因素的角色，当患儿机体受到刺激后，miR-123 的表达上调，并通过激活下游相关反应进而参与哮喘病情的发生发展。为进一步明确miR-123-P13K/AKT 信号通路的价值，研究者以哮喘患儿病情为因变量纳入logistics 回归分析，多因素分析结果显示，肺功能、miR-123、P13K和AKT为影响其病情的独立危险因素，明确了临床可通过早期监控患儿外周血miR-123表达情况对其病情发展做出预测评估，亦为后续哮喘患儿的靶向治疗提供了新思路。

综上所述，支气管哮喘患儿外周血miR-123-P13K/AKT 信号通路呈异常表达，可作为预测评估患儿病情的可靠血清标志物。然而本次实验尚存不足，即本次实验为临床研究，未对相关作用机制进行进一步的探究，故而需进一步设置动物实验予以论证。