食品加工过程中的超高压灭菌技术

张雪颖

（苏州大学剑桥-苏大基因组资源中心，江苏苏州 215123）

非热加工是指利用传统加热以外的机制来灭活食源性微生物的新兴食品保鲜技术，这些技术包括超高压、脉冲电场、电离辐射和紫外线光等，它们最大的优势在于可在常温或低温下对食品中的病原微生物和致腐性微生物进行高效灭活，延长食品保质期，同时不影响食物天然风味和口感。

1 超高压技术概述

超 高 压 技 术（Ultra-high Pressure Processing，UHP）是一种新型的用于灭活食源性病原菌和腐败微生物的非热食品保存技术，该技术的基础是在比热加工温度低得多的情况下应用50～1 000 MPa的静水压，对食品的营养和感官品质损失最小[1]。UHP在食品中的应用可追溯到大约一个世纪前，直到20世纪80年代中期，UHP作为一种商业食品保存技术的应用才重新被燃起。目前，经UHP处理的食品已应用于大米产品、肉类和家禽、蔬菜、果汁和海产品。然而，UHP并不适用于所有类型的食品。例如，草莓等带有内部气穴的食物，在加工过程中易被碾碎。另外，由于不能破坏微生物中的孢子，故而单独UHP不能对一些货架稳定的低酸食品进行灭菌。

不正确折叠方式的蛋白可以在较低的压力（200 MPa)下进行重新折叠[2]。利用酶对热和高压处理的不同稳定性，使用高压选择性地灭活某些酶类以开发出新食品。病毒衣壳蛋白在高压环境下具有不可逆性，高压处理可被用作疫苗研制过程中灭活病毒的方法。然而，由于高压对微生物的高效灭菌的能力，最常见的应用仍然是食品保鲜。

2 UHP诱导的微生物灭活动力学

高压诱导的微生物灭活并不总是遵循一级模型。当绘制存活种群随时间变化的对数图时，首先出现线性下降，其次是灭活率的下降，后者通常被描述为尾迹效应。在热处理过程中也观察到了类似的尾迹效应。对肠道沙门氏菌PT4和大肠杆菌O157:H7的研究表明，热诱导的尾迹效应主要是热休克蛋白等蛋白质的重新合成所致[3]。然而，压力诱导的尾迹效应的作用机理仍未完全清楚。对于某些沙门氏菌而言，在分离、繁殖和再次暴露于压力下时，尾迹效应和原培养物之间并没有明显的压力差异。对大肠杆菌O157:H7的另一项研究发现，与原培养物相比，尾迹培养对UHP具有更高的抵抗力，这可能是由于细胞质膜对压力的稳定性较高所导致。NOMA等同时认为，非离子表面活性剂的加入可能会抑制尾迹现象[4]。

3 UHP引起的微生物损伤

已有研究报道在高压处理后使用差分电镀技术会损伤细胞，处理后的存活细胞在非选择性培养基和添加选择性培养基上均可恢复生长。受损细胞通常在选择性培养基上生长缓慢或不能繁殖，两种培养基之间的群体差异被用来评估压力诱导的损伤。外膜渗透使受损细胞对溶菌酶或疏水化合物（如胆盐）致敏，但减压后受损细胞就能恢复抵抗力[5]。在对大肠杆菌K-12菌株AB1157的研究中发现，99%的存活群体在胆盐的存在下不能再次在回收琼脂上生长，但在胰蛋白酶大豆肉汤中孵育1 h后就完全恢复，受损细胞对酸性条件或盐的敏感性可归因于细胞质膜的损伤所致[6]。与外膜相比，细胞质膜的修复需对代谢的要求更高，且需要更长的时间，而受损细胞的存在将给检测和计数带来困扰。此外，在食品储存期间，恢复食品中受损的病原体可能对人类健康造成危害。MA[7]在调查高压处理受损的大肠杆菌O157:H7的动态恢复过程中发现，随着压力的增加，抑制作用更强，而致命的作用与伤害不一致，证实了UHP损伤的大肠杆菌O157:H7可以在适当的条件下修复。

4 UHP灭活营养菌

革兰氏阳性细菌对高压的抵抗力一般比革兰氏阴性菌强，这可能是由于革兰氏阴性细菌细胞膜的复杂性，这种细胞外膜比革兰氏阳性细菌细胞外膜更容易受到UHP的影响。杆状菌往往比球菌更敏感，球菌表面积减少可能会限制细胞泄漏，这可能是造成UHP失活的部分原因[8]。有研究表明，静止期的细胞比指数期的细胞具有更高的耐压能力，这可能归因于在固定相合成的特殊蛋白质，以抵消高压的有害影响，热、氧化应激、高盐浓度等不良条件也有相似的趋势。大肠杆菌中的RpoS蛋白的存在和单核细胞增生李斯特菌中SigB蛋白的存在部分保护了静止期细胞免受高压的有害影响[9]。固定相位细胞的抗性也可能是由于膜脂的变化、肽聚糖的增稠以及膜蛋白与多肽和脂蛋白之间交联的增加所致。当然也有许多例外，因为细菌对高压的抵抗力表现出较大的变异性，甚至来自同一物种的菌株也是如此。MALONE等[10]调查了15株大肠杆菌O157:H7对500 MPa高压处理的抗性，发现处理后的对数下降范围在0.6～3.4 CFU/mL。

5 影响UHP微生物灭活的因素

在UHP处理期间保持温度对细菌灭活有着显著的影响。有两个因素导致产品的初始温度和加压过程中的温度升高，当然这取决于食品成分。当温度保持在20～35 ℃时，UHP对细菌灭活效果最低；但超过35 ℃时，UHP效果明显，这种现象可能是脂膜在较高温度下容易发生的相变所致。一般来说，随着保温温度的升高，所有病原体的灭活作用都明显增强。高温（＞70 ℃）与压力相结合，几乎可以实现产品的完全灭菌。然而，不同微生物之间的高压和低温协同作用也是有报道的[11]。

（1）食物中的成分影响着微生物的耐压能力。因此，在真正的食品系统中需要更严格的高压处理才能达到与缓冲系统或实验室培养基相同的灭活水平。丰富的培养基具有更强的保护性，可能是因为必需氨基酸和维生素有助于受损细胞的恢复[12]。钙的存在对高压处理的大肠杆菌具有保护作用，这可能是由于加压过程中钙离子结合成分的修复造成的。

（2）低水活度保护微生物免受高压侵害。然而，溶质的性质对高压处理后的细胞失活有着显著的影响。同样，悬浮在氯化钠或氯化钙等离子溶质中的凝固芽孢杆菌细胞比蔗糖或甘油等非离子溶质中的抗性更强。与甘油相比，单糖和二糖对UHP具有更强的保护作用。

（3）低pH值可协同高压作用增强微生物灭活效率。由于水分子的离子离解作用，加压通常会导致食品基质或悬浮缓冲液的pH值降低。压力释放后，pH值恢复到原始值，但pH值的突然变化是否对微生物失活有影响尚不清楚。

（4）食品级添加剂的添加可以提高UHP对病原菌的抗菌效果。通过对常用食品添加剂乳酸菌细菌素nisin和叔丁基对苯二酚（TBHQ）进行检测，显示UHP可能促进nisin穿透细胞质膜，尤其是对革兰阴性菌，导致细菌的灭活。TBHQ的协同效应可归因于通过细胞[Fe-S]簇氧化TBHQ而产生杀菌活性氧所致。

6 UHP对微生物细胞的基本作用

UHP可以引起细胞形态、膜、生化反应和遗传机制的一些变化。随着细胞壁与细胞质膜的分离，加压可以使细胞空泡化，从而使细胞拉伸5～50倍。然而，细胞形态的一些变化是暂时性的，一旦压力释放，细胞会恢复正常形态。

细胞膜被公认为微生物压力损伤的主要靶点之一，加压后细胞膜渗透率的增加表现为ATP或紫外吸收材料的泄漏、渗透反应能力的丧失和荧光染料的吸收增加。压力通过增加脂质分子的堆积密度和诱导脂质与膜蛋白的分离而降低细胞膜的流动性，降低脂膜的熔化温度可以恢复膜的流动性。研究发现，嗜压深海细菌对超高压的适应力涉及膜脂组成从饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸的转变。膜ATP酶活性的丧失也可能导致高压失活，但细胞质功能的部分丧失或革兰氏阴性菌外膜的破坏并不一定会导致细胞死亡。另一项研究发现，在指数期细胞中，膜完整的丧失与UHP介导的致死性有关，而在静止期细胞中，细胞膜则在减压后重新出现。

UHP倾向于生化反应，导致体积减小，并且通常会延缓涉及体积增大的反应。蛋白质内部和蛋白质之间的静电和疏水相互作用尤其对压力敏感，使蛋白质的三级结构和四级结构容易受到高压破坏，而氢键不受UHP的影响。高于300 MPa的蛋白质的不可逆变性是大多数营养细胞和蛋白包被病毒失活的部分原因。

核糖体在加压过程中可能会变形，从而抑制mRNA的附着。电子显微镜下观察发现，压力为150～250 MPa时大肠杆菌的核糖体被完全破坏。近期的研究从遗传学和蛋白质组学的角度探讨了微生物对UHP处理的反应。基因芯片和蛋白质组学的分析揭示了参与微生物耐压性的可能基因和蛋白。通过将无启动子的绿色荧光蛋白基因导入大肠杆菌MG1655基因组片段，筛选出热休克启动子和SOS应答基因，以便在暴露于亚致死高压胁迫后诱导[13]。这些研究表明热休克蛋白在保护或修复UHP所致的损伤方面起着重要的作用。对大肠杆菌基因组的DNA基因芯片分析表明，压力升高可同时引起热应激和冷应激反应。最近的一项DNA基因芯片分析通过比较压力处理（亚致死性）和未处理大肠杆菌的基因转录谱，揭示了参与大肠杆菌O157:H7耐高压的相关基因[10]。研究发现，超过100个基因对亚致死性压力处理有反应，包括应激反应、硫醇-二硫氧化还原系统、铁硫簇和自发突变相关基因。负责[Fe-S]团簇生物合成的全铁操作子在铁饥饿的条件下被下调。某些蛋白质中的[Fe-S]团簇可能使细菌细胞对压力敏感。

7 结语

随着消费者对加工程度最低的新鲜食品的需求增加，人们对开发替代食品保鲜技术的兴趣也开始显现出来。非热加工技术的最大优势是在环境或制冷温度下对食品中的微生物具有有效的抵抗力，从而在不影响感官质量和营养价值的情况下生产出保质期更长、安全性更高的食品。然而，在非热食品保鲜技术的应用方面也存在一些挑战。它对孢子的低效率导致替代技术不可能完全取代热杀菌。此外，非热处理后的尾迹效应和亚致死性损伤可能会给消费者带来一定的风险。深入了解微生物灭活机理，有助于提高微生物灭活效率，从而发挥UHP更大的作用。