磷酸化GluN2B亚基在α-syn A53T转基因小鼠黑质中的表达变化

张佳惠 刘恒 王玉田 姜宏

[摘要] 目的 研究帕金森病转基因模型小鼠中脑黑质（SN）区磷酸化GluN2B（p-GluN2B）亚基的蛋白含量变化。

方法 实验所用动物为12～15月龄α-突触核蛋白（α-syn）A53T转基因小鼠和同窝野生型（WT）小鼠。利用开放旷场实验检测小鼠的运动行为能力，采用蛋白免疫印迹法检测小鼠SN区p-GluN2B及磷酸化α-syn（pS129 α-syn）蛋白表达。

结果 与WT小鼠相比，α-syn A53T转基因小鼠旷场总运动距离减少（t=2.920，P＜0.05），平均运动速度减慢（t=2.518，P＜0.05），中脑SN区p-GluN2B和pS129 α-syn蛋白表达量明显升高（t=2.470、3.533，P＜0.05）。

结论 α-syn A53T 转基因小鼠SN区GluN2B亚基活性增强且可能参与多巴胺能神经元的变性死亡过程。

[关键词] 帕金森病；小鼠，转基因；黑质；α突触核蛋白；GluN2B

[中图分类号] R338.2

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2022）05-0643-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.166

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20221021.1358.001.html;2022-10-24 09：36：11

CHANGE IN THE EXPRESSION OF PHOSPHORYLATED GLUN2B SUBUNIT IN THE SUBSTANTIA NIGRA OF α-SYNUCLEIN A53T TRANSGENIC MICE

ZHANG Jiahui， LIU Heng， WANG Yutian， JIANG Hong

（State Key Disciplines： Physiology （in Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）;

[ABSTRACT] Objective To investigate the change in the expression of phosphorylated GluN2B （p-GluN2B） subunit in the substantia nigra （SN） of transgenic mice with Parkinsons disease （PD）.

Methods The α-synuclein （α-syn） transgenic mice and wild-type （WT） littermates， aged 12-15 months， were used in this experiment. The open field test was used to observe motor behavior abilities， and Western blotting was used to measure the protein expression of p-GluN2B and phosphorylated α-syn （pS129 α-syn） in the SN of mice.

Results The open field test showed that compared with the WT mice， the α-syn A53T transgenic mice had significant reductions in total movement distance （t=2.920，P<0.05） and mean movement speed （t=2.518，P<0.05）， and Western blotting showed that compared with the WT mice， the α-syn A53T transgenic mice had significant increases in the protein expression levels of p-GluN2B and pS129 α-syn in the SN of the midbrain （t=2.470，3.533;P<0.05）.

Conclusion The activity of GluN2B subunit in the SN of α-syn A53T transgenic mice is enhanced， which may be involved in the degeneration and death of dopaminergic neurons.

[KEY WORDS] Parkinson disease; mice， transgenic; substantia nigra; alpha-synuclein; GluN2B

在帕金森病（PD）中，α-突触核蛋白（α-syn）在Ser-129 位点的磷酸化促进了α-syn的积累及路易小體的形成，对PD的发生发展起到重要作用^[1-4]。N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体为离子型谷氨酸受体，具有高钙离子通透性，在学习与记忆中发挥重要作用^[5-6]。该受体过度激活会导致细胞功能障碍和死亡，被认为是与许多神经系统疾病相关的神经元损伤的介质^[7-8]。NMDA受体GluN2B亚基的C末端可以被酪氨酸激酶Fyn激活而发生磷酸化聚集在突触后膜上，而细胞内Fyn的表达可能受到α-syn的调控^[9-10]。然而，NMDA 受体参与PD的发病机制仍然不明确。本实验旨在通过检测α-syn A53T 转基因小鼠和野生型（WT）小鼠黑质区（SN）磷酸化GluN2B（p-GluN2B）蛋白表达水平，探究随PD进展GluN2B亚基活性变化，以期为PD提供潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 α-syn A53T转基因小鼠购自南京大学模式动物研究所，进行基因型鉴别，获得α-syn A53T^+/+小鼠和α-syn A53T^＋/－小鼠。本实验选择12～15月龄的α-syn A53T^+/+小鼠和同窝WT小鼠各5只作为研究对象。小鼠饲养于SPF级环境中，设定室温为（22±2）℃、白昼与黑夜的光照时间为1∶1。

1.1.2 仪器及试剂 p-GluN2B抗体（ABcam）；磷酸化α-syn（pS129 α-syn）抗体、GAPDH抗体（Cell Signaling Technology）；山羊抗兔二抗（Absin）；BCA试剂盒、SDS-PAGE loading buffer、RIPA裂解液、分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液（康为世纪）；ECL显色发光液、PVDF膜（Millipore）；电泳仪、电转仪（BioRad）；凝胶成像系统（General Electric Company）。

1.2 实验方法

1.2.1 旷场实验 应用50 cm×50 cm的方盒旷场，方盒周壁及底部的颜色均不透明，将方盒底部平均分为4×4的16个小方格。摄像头置于方盒上方，可观察整个旷场，将小鼠轻轻放置在方盒中，黑暗中进行10 min的视频录制。每只小鼠测试结束后，清理方盒并应用乙醇消除气味后晾干，以防对下一只小鼠测试产生影响。采用SMART软件分析小鼠总运动距离及平均运动速度等数据。

1.2.2 蛋白免疫印迹法检测SN区蛋白表达 小鼠麻醉后断头取脑，在冰上按照脑图谱完整取出中脑SN区。向脑组织中加入100 μL RIPA蛋白裂解液静置，置于研磨机中研磨。在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，离心结束后取上清液80 μL，在酶标仪上用BCA 法测定蛋白浓度。加入5×蛋白loading buffer混匀，100 ℃金属浴煮沸，根据BCA法检测数据确定上样量。按照所需蛋白分子量配胶，电泳完成以后转膜（300 mA、100 min）。按照Marker切下需要的目标条带，用100 g/L脱脂奶粉封闭，室温孵育2 h；分别加入用一抗稀释液配制的p-GluN2B抗体（1∶1 000）、pS129 α-syn 抗体（1∶1 000）、GAPDH抗体（1∶10 000），置低速摇床上4 ℃孵育过夜；以TBST缓冲液洗脱3次，半小时后加入山羊抗兔的二抗（1∶10 000，TBST缓冲液配制），置摇床上室温孵育1 h；以TBST缓冲液洗脱3次，擦干TBST后，加入适量ECL化学发光液进行显影。采用Image J软件分析条带灰度值，结果以p-GluN2B、pS129 α-syn与内参GAPDH 灰度值的比值表示。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。计量资料结果以±s表示，两组比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 α-syn A53T^+/+小鼠运动行为能力改变

α-syn A53T^+/+小鼠和WT小鼠在开放旷场的总运动距离分别为（2 575.0±293.7）、（3 655.0±225.1）cm（n=5），α-syn A53T^+/+小鼠旷场总运动距离较WT小鼠减少，差异具有统计学意义（t=2.920，P＜0.05）。α-syn A53T^+/+小鼠和WT小鼠的平均运动速度分别为（4.302±0.480）、（5.898±0.415）cm/s（n=5），α-syn A53T^+/+小鼠平均运动速度较WT小鼠减慢，差异具有统计学意义（t=2.518，P＜0.05）。

2.2 α-syn A53T^+/+小鼠中脑SN区p-GluN2B 和pS129 α-syn蛋白表达变化

α-syn A53T^+/+小鼠和WT 小鼠中脑SN区p-GluN2B蛋白的表达水平分别为1.115±0.141和0.706±0.087（n=5），α-syn A53T^+/+小鼠SN区p-GluN2B蛋白的表达水平较WT小鼠明显升高，差异具有统计学意义（t=2.470，P＜0.05）。α-syn A53T^+/+小鼠和WT 小鼠SN区pS129 α-syn 蛋白的表达水平分别为1.277±0.219和0.433±0.094（n=5），差異具有统计学意义（t=3.533，P＜0.05）。

3 讨 论

NMDA受体为谷氨酸门控离子通道，在中枢神经系统中广泛表达，并在兴奋性突触传递中起着关键作用^[11]。NMDA受体共包含3种类型的亚基（GluN1～3），亚基结构间具有高度同源性，均由氨基端、配体结合区、跨膜区及羧基末端4个结构域组成^[12-13]。越来越多的研究表明，在PD细胞模型和PD病人脑组织中，纹状体和伏隔核中谷氨酸与NMDA受体结合显著增加，而这可能会加速神经元退化过程^[14-15]。有文献报道，在亚急性1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）小鼠模型中，可以通过抑制mGlu2/3受体配体影响突触后Fyn/NMDA受体的功能^[16]。最新的研究结果表明，在鱼藤酮小鼠模型中，GluN2B在mGluR5介导的内质网应激和DNA损伤中发挥着重要作用^[17]。

上述研究揭示，在PD的进展过程中，NMDA受体介导的谷氨酸兴奋性毒性发挥作用。本文研究结果显示，12～15月龄α-syn A53T^+/+小鼠运动能力受损，与之前有关研究报道相吻合^[18]。本文结果还显示，α-syn A53T^+/+小鼠SN区pS129 α-syn和p-GluN2B蛋白表达水平明显升高，说明在SN区出现了α-syn聚集，从而可能过度激活Fyn使GluN2B亚基表达过磷酸化。有研究报道，Fyn在Tyr1472处磷酸化GluN2B会抑制与网格蛋白接头AP-2的结合，最终会抑制细胞表面含有GluN2B的NMDA受体的内化^[19-20]。因此我们推测，当p-GluN2B增多时，由于Fyn活性增强使GluN2B内化减少，导致大量Ca²⁺内流，这可能成为神经元损伤的重要原因。本研究为阐明NMDA受体参与PD发生发展的机制提供了思路，其具体机制还有待进一步探讨。

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（本文編辑 马伟平）