皮肤扁平苔藓中miR-27b与相关蛋白表达及意义

杨培 梁淑雅 王苗苗 韩莎莎 李媛媛 王君

[摘要] 目的 探讨皮肤扁平苔藓（CLP）中microRNA-27b（miR-27b）与相关蛋白的表达水平及意义。

方法 采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法，检测40例CLP病人（CLP组）皮损组织及40例健康人（Con组）正常皮肤组织中miR-27b的表达水平。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法，检测两组皮肤组织中白细胞介素1β（IL-1β）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达水平。采用Spearman相关分析法分析CLP组皮损组织中miR-27b、IL-1β、MMP-2表达水平之间的相关性。

结果 与Con组相比，CLP组皮损组织中miR-27b表达水平明显下调（t=2.501，P＜0.05），IL-1β和MMP-2表达水平明显上调（t=－2.383、－2.487，P＜0.05）。Spearman相关性分析显示，CLP组皮损组织中miR-27b与IL-1β、MMP-2表达水平呈负相关（r=－0.361、－0.385，P＜0.05），IL-1β与MMP-2表达水平呈正相关（r=0.332，P＜0.05）。

结论 miR-27b及其相关蛋白可能参与了CLP的发病过程。

[关键词] 扁平苔藓；皮肤疾病；微RNAs；白细胞介素1β；基质金属蛋白酶2

[中图分类号] R758.65

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2022）05-0694-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.127

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20220713.0951.003.html;2022-07-14 08：55：59

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF MICRORNA-27B AND RELATED PROTEINS IN CUTANEOUS LICHEN PLANUS

YANG Pei， LIANG Shuya， WANG Miaomiao， HAN Shasha， LI Yuanyuan， WANG Jun

（Department of Dermatology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the expression levels and significance of microRNA-27b （miR-27b） and related proteins in cutaneous lichen planus （CLP）.

Methods Quantitative real-time PCR was used to measure the expression level of miR-27b in the skin lesions of 40 CLP patients （CLP group） and the normal skin tissue samples of 40 healthy controls （Con group）. ELISA was used to measure the expression levels of interleukin 1β （IL-1β） and matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） in skin tissue of the two groups. A Spearman correlation analysis was used to analyze the correlation between the expression levels of miR-27b， IL-1β， and MMP-2.

Results Compared with the Con group， the CLP group had a significant reduction in the expression level of miR-27b （t=2.501，P<0.05） and significant increases in the expression levels of IL-1β and MMP-2 in skin lesion （t=-2.383，-2.487;P<0.05）. The Spearman correlation analysis showed that in the CLP group， miR-27b was negatively correlated with IL-1β and MMP-2 （r=-0.361，-0.385;P<0.05）， and IL-1β was positively correlated with MMP-2 （r=0.332，P<0.05）.

Conclusion This study shows that miR-27b and related proteins may be involved in the pathogenesis of CLP.

[KEY WORDS] lichen planus; skin diseases; microRNAs; interleukin-1beta; matrix metalloproteinase 2

扁平苔蘚（LP）是一种皮肤和黏膜的炎症性疾病，其患病率约为1％，女性患病率高于男性。尽管LP的发病机制尚不完全清楚，但是T细胞介导的免疫和炎性反应在其发病机制中发挥了重要作用。microRNA（miRNA）是小的非编码RNA，可通过调控相关基因的表达来调节细胞活性，在自身免疫以及细胞增殖、分化和凋亡中起关键作用，而miRNA失调可能与自身免疫和炎症性疾病的发病机制有关。miR-27b是miRNA家族中的一员，有研究显示，在口腔扁平苔藓（OLP）中其表达水平降低。经双荧光素酶报告基因实验验证，白细胞介素1β（IL-1β）是miR-27b的潜在靶蛋白。已有研究表明，皮肤扁平苔藓（CLP）组织中IL-1β的表达上调。然而，miR-27b靶向IL-1β是否在CLP的发病机制中发挥作用还未被证实。LI等通过Western blot检测发现，miR-27b过表达明显抑制血小板衍生生长因子BB诱导的基质金属蛋白酶9（MMP-9）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达升高。然而，miR-27b及其相关蛋白MMP-2在CLP中的表达关系尚未见报道。本研究旨在探讨miR-27b与其靶蛋白IL-1β以及相关蛋白MMP-2在CLP中的表达水平及意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象

2019年5月—2020年5月，选取于青岛大学附属医院皮肤科就诊的CLP病人40例（CLP组），并采集皮损组织标本。CLP组纳入标准：临床表现典型并经组织病理学确诊（典型病例见图1），无系统性疾病，3个月内未使用免疫抑制剂或糖皮质激素类药物。同期选取在青岛大学附属医院美容外科手术的40例健康人（Con组）作为对照，收集手术切取的正常皮肤组织标本。CLP组男22例，女18例，年龄25～64岁；Con组男19例，女21例，年龄19～61岁。两组性别和年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准，受试者自愿签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量PCR检测miR-27b的表达

采用Trizol法（试剂购自日本Takara公司）提取两组皮肤组织总RNA，并参照逆转录试剂盒（日本Takara公司）操作步骤将定量后的RNA逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，将配制好的20 μL反应体系（含有2×SYBR Green PCR Master Mix 10.0 μL，cDNA 1.0 μL、上下游引物各0.4 μL、HO 8.2 μL）按照设定的反应条件（94 ℃、5 min，94 ℃、15 s，58 ℃、15 s，72 ℃、30 s，共循环35次）上PCR仪进行扩增。miR-27b和U6引物由上海生工公司合成，其序列见表1。采用2法计算目的基因的相对表达水平。

1.3 酶联免疫吸附测定法检测IL-1β和MMP-2的表达

根据人IL-1β和MMP-2酶联免疫吸附测定试剂盒（日本Takara公司）说明书操作步骤检测两组皮肤组织中IL-1β以及MMP-2的含量，于450 nm波长处依序测量各孔的光密度（OD）值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料以±s形式表示，两组间比较采用独立样本t检验。miR-27b、IL-1β、MMP-2表达水平之间的相关性分析采用Spearman相关分析法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组miR-27b、IL-1β、MMP-2表达水平比较

CLP组miR-27b的表达水平明显低于Con组，IL-1β和MMP-2的表达水平明显高于Con组，差异均有统计学意义（t=-2.487～2.501，P＜0.05）。见表2。

2.2 miR-27b、IL-1β、MMP-2表达水平的相关性

Spearman相关分析显示，CLP组皮损组织中miR-27b与IL-1β、MMP-2表达水平呈负相关（r=－0.361、－0.385，P＜0.05），IL-1β与MMP-2表达水平呈正相关（r=0.332，P＜0.05）。见图2。

3 讨 论

LP是一种慢性自身免疫疾病，T细胞介导的免疫反应对基底层角质形成细胞造成破坏在LP发病机制中发挥重要作用。miR-27b为角质形成细胞特异性miRNA，参与了角质形成细胞的分化。WANG等研究证实，miR-27b改善了角质形成细胞的迁移，而miR-27b下调则增加了角质形成细胞的凋亡。有研究表明，miR-27b作为OLP的生物标志物具有很高的敏感性（高达100%），其在OLP黏膜组织、血清和唾液中的表达均显著下调。ZHANG等的研究证实，OLP的临床严重程度与miR-27b下调水平有关。CHEN等的研究发现，miR-27b通过靶向Polo样激酶2（PLK2）促进OLP角质形成细胞增殖。另有研究证实，OLP黏膜组织中miR-27b-3p通过环蛋白D/Bcl2信号通路调控角质形成细胞凋亡。ZHANG等认为，OLP上皮角质形成细胞中miR-27b的下调可能是活化细胞毒性T细胞特异性炎症反应的一部分，并且可能触发上皮细胞凋亡。到目前为止，还未见针对miR-27b在CLP中表达的研究。

研究表明，LP的组织病理学特征之一是基底膜的破坏。基底膜依赖性酶的蛋白水解活性升高可造成基底膜损伤，进而触发角质形成细胞的凋亡。基质金属蛋白酶是锌和钙依赖性的蛋白水解酶，MMP-2是所有基质金属蛋白酶中分布最广泛的一种。MMP-2或Ⅳ型胶原酶可以破坏基底膜的主要糖蛋白成分Ⅳ型胶原蛋白，并参与血管和炎症过程的调节。在对卵巢癌细胞和视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）的研究中发现，miR-27b可以下调MMP-2的表达。WANG等研究证实，OLP中MMP-2的表达显著上调，miR-125b可通过PI3K/Akt/mTOR途径靶向MMP-2抑制角质形成细胞的增殖并促进角质形成细胞凋亡。关于CLP中MMP-2表达的研究结果仍有差异。GIANNELLI等首次研究了CLP和MMP-2的关系，结果显示，在CLP急性期MMP-2的表达和活性增加，并暗示MMP-2和基质金属蛋白酶组织抑制因子2（TIMP-2）之间的失衡可能在基底膜破坏中发挥作用。但GUNDUZ等研究发现，MMP-2在CLP皮损的表皮基底层中表达弱，在基底层破坏显著区域甚至不表达，认为这一结果可以用表皮基底层的破坏来解释，得到不同的结果可能因疾病所处阶段不同所致。

目前生物信息学研究证明，IL-1β是miR-27b的靶蛋白之一。人角质形成细胞是促炎细胞因子IL-1β的主要来源。IL-1β作为角质形成细胞激活的启动子，可激活各种细胞内信号传导途径。此外，IL-1β已被证实有促进胶原酶合成、抑制胶原分泌的作用。在一项关于成纤维样滑膜细胞凋亡的研究中，作者发现miR-27b表达增加可抑制IL-1β表达和核因子κB（NF-κB）信号传导。另有研究表明，IL-1β以剂量和时间依赖性方式提高前交叉韧带成纤维细胞中MMP-2蛋白表达和酶活性。本研究检测了miR-27b、IL-1β和MMP-2在CLP中的表达水平，结果显示，与Con组相比，CLP组miR-27b的表达水平显著下降，IL-1β和MMP-2的表達水平显著上调。相关性分析显示，CLP组病人miR-27b与IL-1β和MMP-2的表达水平均呈显著负相关，IL-1β与MMP-2的表达水平呈显著正相关。提示miR-27b的异常表达可能导致IL-1β、MMP-2的表达上调，破坏基底膜，触发角质形成细胞的凋亡，参与CLP的发病过程。

綜上所述，miR-27b可能通过负调控相关蛋白的表达参与CLP的发病过程。这为进一步揭示LP的发病机制提供了有益参考，为未来该病治疗靶点的筛选提供了一定的理论依据。

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（本文編辑 马伟平）