壳聚糖对植物病原体的作用机制及其影响因素

隋振全，范金石,2，尹崇山，毛金超

（1青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266042；2省部共建生态化工国家重点实验室培育基地，山东 青岛 266042；3山东信得科技股份有限公司，山东 诸城 262200）

0 引言

微生物引发的各种植物病害使农作物的产量降低、质量下降，进而给相关从业者造成巨大经济损失。在过去的很长时间里，农作物病害的防护主要依赖于化学农药，但过度使用化学农药会危害生物的多样性、破坏生态平衡、损害人类健康。同时，化学农药的连续使用会引起病菌的药抗性不断提高或致其发生变异，使得化学农药的药效逐年下降。而为了提高病害防治效果，人们不得不加大化学农药的使用频次和使用量。这种“病菌药抗性提高”与“化学农药使用量增大”间的恶性循环，终将会危害环境生态和人类自身。近年来，“绿色健康、可持续发展”的理念已深入人心，开发新型绿色环境友好的植物病害防治剂已成为农业高质量发展的迫切需求[1]。

壳聚糖是自然界第二大天然生物质资源甲壳素（又称几丁质）在一定条件下部分脱乙酰化制得的一种天然阳离子多糖[2]，具有独特的性质[3-5]，如生物相容性、生物降解性、无毒性、抗菌性等，在农业、医疗、纺织和食品等领域具有广泛的应用潜力[6-7]。在农业上，壳聚糖除表现出优良的抗菌活性外[8]，还具有提高植物的免疫力、促进植物生长发育、提高种子发芽率、提高作物产量、减少植物蒸腾作用等多种效能[9-11]，因此，开发以壳聚糖为活性成分的新型植物病害防治剂以满足“绿色健康、可持续发展”的农业发展要求具有极大的应用前景[12]。为开发此类新型植物病害防治剂提供参考，本文着重阐述了壳聚糖对植物病原体的作用机制及其影响因素，并展望了壳聚糖作为新型植物病害防治剂的发展应用前景

1 壳聚糖对植物病原体的作用机制

壳聚糖对大部分的植物病原体（真菌、细菌和病毒）表现出良好的抗性，可以抑制其生长或直接杀死病原体[13]。当前，壳聚糖对植物病原体的作用机制主要包括以下几方面。

1.1 电荷作用

壳聚糖溶于酸溶液后产生的-NH3+会与带有负电荷的病原体细胞表面发生强烈的电性相吸，影响细胞膜的结构，使细胞膜的通透性发生变化，从而引起细胞内物质外泄，最终导致病原体的生命活动受损[14-16]。此外，质子化的壳聚糖氨基可以和微生物细胞壁中的二价金属离子（如Ca2+和Mg2+）通过电荷作用结合在一起，能有效阻止毒素的产生、降低毒素对植物的侵害[17]。

分子量较低的壳聚糖可以穿过细胞膜进入病原体细胞的内部[18]，与病原体细胞内带有负电荷的细胞质结合，产生絮凝作用，进而影响细胞的正常代谢，抑制病原体生长或杀死病原体[19]。但是，也有观点认为，低分子量的壳聚糖进入病原体细胞内部，可能与病原体细胞内部的DNA 或RNA 结合，从而起到对病原体生长抑制或杀死作用[20]。

1.2 沉积作用

壳聚糖在病原体细胞表面沉积，进而影响细胞膜的通透性，导致病原体细胞无法获得生长所需的全部营养物质，并且使细胞内部产生的代谢废物累积在细胞内，进而抑制了病原体细胞生长发育或导致病原体死亡[21]。

Acharya等[22]研究表明：壳聚糖溶液处理后的大肠杆菌(Escherichia coli)表面会有部分壳聚糖沉积，导致吸收营养物质困难，最终导致部分大肠杆菌生长缓慢和部分大肠杆菌死亡。

1.3 螯合作用

壳聚糖分子中的氨基能够将孤对电子提供给金属离子形成螯合物[23]，使其对金属离子表现优异的螯合性能[24]。因此，壳聚糖可以与病原体细胞中的金属离子及其所需营养物质中的微量元素发生螯合作用[25-26]，从而抑制病原体细胞的生长发育。值得注意的是，螯合性能是通过壳聚糖分子结构中未被质子化的氨基来发挥作用，当壳聚糖溶解于酸性溶液中时，绝大部分氨基都发生质子化，此时，螯合作用可能不再是壳聚糖抑制或杀死病原体的主导机制。

1.4 诱导作用

植物在进化过程中，进化出一套完整的防御体系来应对病原体的胁迫，并利用各种化学物质作为信号因子来激发防御系统。常见的信号因子通常称之为植物激素，如水杨酸、茉莉酸、脱落酸、生长素、乙烯、细胞分裂素等。研究表明，壳聚糖可作为一种诱导子诱导信号因子的产生进而激发植物的防御系统，或作为一种激发子来激活植物的免疫反应[26-27]。

Marta等[28]用壳聚糖溶液浇灌处理番茄植株，对其根系分泌物进行分析发现多种植物防御信号因子如水杨酸、茉莉酸和脱落酸等的分泌量显著提高；同时，与空白对照组相比，经壳聚糖溶液处理后的番茄植株的根系分泌物对根系寄生的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的生长有着2 倍的抑制。Manjunatha 等[29]发现壳聚糖处理过的被霜霉病病株感染的小麦内与防御相关的酶（几丁质酶和过氧化物酶）的含量比未采用壳聚糖处理的被霜霉病病株感染的小麦高；温室和田间试验表明，壳聚糖能很好地激发小麦的防御系统来抵抗霜霉病，用壳聚糖处理的小麦对霜霉病的防治效果分别达到79.08%和75.80%。

2 影响壳聚糖对植物病原体作用的因素

2.1 病原体

2.1.1 病原体的类型 病原体种类繁多，其细胞结构差别较大，壳聚糖对其发挥作用的机制不同，因而表现出来不同的作用效果。研究表明，壳聚糖对真菌的敏感程度要高于细菌[12]，这可能和真菌细胞壁中的主要成分为几丁质有关。壳聚糖来源于几丁质，可激发植物的免疫系统促进几丁质酶的产生发生，进而激发植物体内的免疫反应[30]。

Varma 等[31]从贝壳中提取出壳聚糖，采用琼脂扩散法研究浓度为200 µg/mL 的壳聚糖对七种病原体（大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷白氏菌(Klebsiella pneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)琼脂培养基的抑制效果，其抑制区直径分别为9、7、6、7、5、6、9 mm，均表现出良好的抑制性能。

2.1.2 病原体的生长阶段 对应病原体不同的生长发育阶段，壳聚糖表现出不同的抑制效果。Orellano等[32]在培养金黄色葡萄球菌V329(S.aureus V329)的初始阶段加入一定量的200µg/mL 壳聚糖溶液，通过CFU 计数确定菌落的生长情况。与空白对照试验相比发现：在金黄色葡萄球菌V329 培养的前2 h 内，壳聚糖几乎没有抑菌效果；培养6 h左右时，壳聚糖的抑菌效果最好；而培养8～12 h内的生长抑制效果基本一致。Chen等[33]研究了壳聚糖对金黄色葡萄球菌CCRC 12657(S.aureus CCRC 12657)不同生长发育阶段的抑制效果，结果表明：壳聚糖对细胞指数期晚期菌落处理10 h后细胞就全部失活，而处于稳定期和指数期中期的金黄色葡萄球菌菌落还有大约35%左右的存活率。

2.2 壳聚糖

2.2.1 脱乙酰度 壳聚糖的脱乙酰度对壳聚糖的生物活性有着重要的影响，壳聚糖的脱乙酰度越高，壳聚糖的氨基质子化后所带有的正电荷越高，其抗菌活性越强[34]。例如，随着脱乙酰度(83.9%～92.2%)的提高，壳聚糖对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)的抑制效果不断提高[35]。Byun等[36]研究发现脱乙酰度为81.56%的壳聚糖对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌效果远远优于脱乙酰度为62.71%的壳聚糖。

2.2.2 分子量 截止目前，壳聚糖的抑菌效率和其分子量大小间的关系尚未形成一致的结论，甚至从不同实验中得出的研究结论正好相反[37-38]。这可能与病原体的种类、壳聚糖的其他性质及壳聚糖在不同情形下表现出不同的抑菌机制等多种因素有关。

Lana 等[39]研究了低分子量(75554.8±0.01 g/mol)、中 分 子 量(140469.4 ± 0.01 g/mol) 和 高 分 子 量(247795.2±0.01 g/mol)的壳聚糖对热带念珠菌(Candida tropicalis)CEMM-03-06-068、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)CEMM-01-01-193和白色念珠菌(Candida albicans)CEMM 01-05-005 达到完全抑制所需的最低浓度，研究发现：不同分子量壳聚糖对白色念珠菌CEMM 01-05-005达到完全抑制所需的最低浓度为512、512、512 µg/mL，不同分子量壳聚糖对热带念珠菌CEMM-03-06-068达到完全抑制所需的最低浓度分别为16、64、256 µg/mL，不同分子量壳聚糖对近平滑念珠菌CEMM-01-01-193达到完全抑制所需的最低浓度分别为16、32、128 µg/mL。Zheng 等[40]研究了浓度为0.25%(g/g)，分子量分别为＜5k、48.5k、72.4k、129k、166k、305 kDa的壳聚糖溶液对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌效果，结果表明：随着分子量的提高壳聚糖溶液对大肠杆菌的抑菌效果不断下降，抑菌率分别为50%、30%、5%、0%、0%、0%；随着分子量的提高壳聚糖溶液对金黄色葡萄的抑菌效果不断提高，抑菌率分别为0%、0%、0%、40%、95%、99%。

2.2.3 来源 众所周知，壳聚糖是由甲壳素脱乙酰化得到的，而甲壳素广泛存在于甲壳类动物、昆虫、真菌和藻类等物质中[41-43]，不同来源的壳聚糖有着不同的生物活性。Chien 等[44]测试了从香菇菌柄和蟹壳所提取壳聚糖的抗菌活性，结果表明两种壳聚糖均有良好的抑菌性能，但香菇菌柄壳聚糖的抑菌率优于蟹壳壳聚糖。Byun 等[36]也研究发现从螃蟹的不同部位提取出的壳聚糖面对相同的病菌，其抑菌率也有着较大的差异。Chang等[45]比较了木耳中提取的壳聚糖与市售壳聚糖的抑菌效果，结果发现从木耳中提取的壳聚糖对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出更强的抑菌活性。

2.3 使用条件

2.3.1 浓度 随着壳聚糖溶液浓度的提高，溶液中游离氨基的含量也不断提高，其抑菌效果也将随之增大。Wang 等[46]研究发现随着壳聚糖溶液浓度增大(0～150 µg/mL)，壳聚糖溶液对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的生长抑制率逐渐提高，在浓度超过39µg/mL时抑制率达到100%。Chien 和Chou[47]研究了脱乙酰度为94.2%、相对分子质量为92.1 kDa(A)和357.3 kDa(B)的壳聚糖对意大利青霉菌(Penicillium italicum)的抗菌性能，结果表明：壳聚糖浓度为0.1%时，壳聚糖A和B对霉菌的生长抑制率分别为76.2%和71.2%；当壳聚糖浓度为0.2%时，则相应增大到78.6%和90.5%。

2.3.2 pH pH 对壳聚糖的抑菌性能影响巨大，因为壳聚糖的溶解性和氨基质子化程度都与pH 直接相关。壳聚糖只溶解于酸性介质之中[48]，当pH＜6.5时，它的抑菌活性和氨基质子化程度均随着pH 的降低而不断增强[12]；而当溶液pH 6.5～7 时，由于壳聚糖的氨基质子化程度极低因而几乎没有抑菌活性。Piegat 等[49]研究了不同pH 下壳聚糖溶液对大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的杀菌率，通过与空白对照试验相比发现：随着pH(pH＜6)的降低壳聚糖溶液的杀菌率逐渐提高，但当pH＜5 时，酸对病原体的杀菌效果占据主要地位。

2.3.3 温度 温度对壳聚糖的抗菌活性有很大影响，在4～37℃的范围内，壳聚糖的抑菌活性随温度的升高而逐渐增强。这主要是因为温度会影响壳聚糖与细胞的反应速率和细胞表面可结合位点数目的变化所导致的，较低的温度会改变细胞的表面结构、减少壳聚糖的表面结合位点[50]，进而引起壳聚糖抑菌性能的下降。Ardila 等[51]研究了在37℃、20℃和7℃下壳聚糖溶液对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的抑菌效果，结果为37℃时抑菌效果最好，20℃次之，7℃最差。

2.4 其他因素

对于工业化应用而言，批量制备是必要的，然而在货架储藏期间，储存温度和时间也会对壳聚糖的抑菌功效也会产生影响。这是因为在储存期间，壳聚糖的某些特性，如粘度或分子量，会发生改变，从而对其抑菌活性产生一定影响。Hong等[52]研究了在25℃和4℃下，分别采用乙酸溶解得到的壳聚糖溶液储存15周后粘度和对金黄色葡萄球菌的杀菌效果的变化，结果表明：乙酸壳聚糖溶液在4℃下储存15 周后粘度和杀菌效果下降了初始值的46%和10%，在25℃下降了81%和18%。研究表明，壳聚糖溶液的粘度和抑菌活性随着储存时间和温度的增加而降低。

3 展望

基于壳聚糖优良的抗菌特性以及天然无毒、生物相容性良好和可生物降解性等特性，开发壳聚糖基植物病害防治剂，符合农业的绿色可持续发展需求，能够替代相关化学农药的使用，尤其是应用在高品质、高经济效益农作物的种植上更能彰显出其特色优势。

当前壳聚糖对植物病原体的作用研究还不够全面系统，其抑菌机理多数以推测和假设为主，不同的研究方法所得出的研究结果间也存在差异。因此，为更好地开发以壳聚糖为活性成分的植物病害防治剂，还应加强以下几方面的研究：（1）利用先进的仪器设备（如冷冻电镜和扫描透射电子显微镜）考察壳聚糖和植物病原体之间的作用方式，进一步剖析壳聚糖的抑菌机制；（2）通过建立三维生物细胞模型分析壳聚糖对植物病原体的作用机制，并与实验结果印证；（3）逐步建立起完整的壳聚糖对病原体作用的数据库，以避免壳聚糖的自身因素（如分子量、脱乙酰度和来源）和病原体种类所引起的研究结果间的差异；（4）建立统一的或分类标准，以克服不同研究方法所得结论间存在差异甚至出现截然相反结论的现象发生。