SFRP5基因干扰载体的构建及鉴定

郑 强

黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319

随着生活结构的调整以及饮食质量的提高，高能食物已成为人类普遍的食物来源。虽然脂肪组织可作为机体重要的能量来源，但脂肪摄入的过多会间接导致机体发病，如重度肥胖、高血压、脂肪肝、高血脂等疾病，对人类健康造成了巨大的危害。从细胞层面分析，脂肪的积累既包括脂肪细胞数量的增多，又包括脂滴体积的增大。从动物个体水平分析，多个脂肪细胞的增殖和分化必然导致机体肥胖和疾病发生。脂肪组织可分为棕色脂肪组织（BAT)和白色脂肪组织（WAT)。棕色脂肪细胞中分布着许多脂肪滴，其细胞核分布于细胞的中央，含有许多微细的血管，棕色脂肪组织在成年动物中很少发现，仅在特殊情况下出现。然而，幼龄动物和冬眠动物中含量较多，主要存在于哺乳动物的肩胛区、颈后背部和腺体的腋窝下部。此外，有研究发现脂肪组织自身也可以分泌脂肪细胞因子，参与调控动物机体能量代谢和能量平衡。分泌型卷曲相关蛋白5是一种调控脂肪的重要细胞因子，其在机体能量代谢过程中发挥了重要作用，但其具体的调控机制尚不明确。因此，揭示脂肪细胞增殖分化时是否受到SFRP5的调控展开具体研究，对机体肥胖的预防及与肥胖相关疾病的治疗奠定基础[1]。脂肪组织不仅完成了机体大部分能量的存储，还可以调节体内的生理机能。脂肪组织沉积主要通过脂肪细胞数量增多及脂滴积累两种形式实现。脂肪细胞增殖与分化受诸多因素影响，Wnt信号通路是较早发现的传统信号通路，参与脂肪细胞增殖分化的调控。SFRP5具有双向调节作用，可抑制Wnt信号的转导，两者共同作用，共同影响着脂肪细胞的增殖分化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 载体

从VectorBuilder公司购买SFRP5重组腺病毒干扰载体，载体名称pAV-shRNA-EGFP（VB161026-1127kyf），pAV-mSFRP5shRNA-EGFP（VB171121-1371tah）。

1.1.2 细胞系

本实验室保存的HEK293A细胞、3T3-L1细胞均购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.3 试验试剂DMEM培养基、酒精、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青-链霉素溶液、质粒提取试剂盒。

1.1.4 主要仪器

CO2细胞培养箱、冰箱、酶标仪、液氮罐、水浴锅、离心机、凝胶成像仪、磁力搅拌器、培养瓶、培养皿（10 mm、60 mm）、多孔培养板（12、48、96孔）、吸管、移液管、移液枪、移液枪头、显微镜。

1.2 方法

1.2.1 SFRP5腺病毒干扰载体的鉴定

将购买的pAV-shRNA-EGFP和pAV-mSFRP5shRN A-EGFP载体在含卡那霉素的LB固体培养基中培养，挑取单克隆，扩繁后，用质粒提取试剂盒将其中的质粒提取出来。然后通过PacI进行酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳检测，选取阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定。

1.2.2 病毒制备

将无血清双抗的培养液（Opti-MEMI）稀释4 μg质粒，稀释至250 μL。将Opti-MEMI稀释10 μL Lipofectamine TM2000稀释25倍，在室温下培养25 min。将 Lipofectamine TM2000和质粒混合，获得混合液，室温培养20 min。将混合液放入CO2培养箱6 h，6孔板需要设置对照组。24 h的转染后，用荧光显微镜下观察绿色荧光和细胞的病变情况。10 d后将细胞收集，在液氮罐和恒温水浴锅中反复冻融5次，离心，分离上清液，用于细胞感染。

1.2.3 病毒扩繁

将HEK293A细胞培养到培养皿面积90%时，腺病毒感染8个培养皿。24 h后，显微镜观察到少许细胞漂浮。再经过24 h，绝大多数细胞漂浮，收取细胞。离心10 min转速1 200 rpm，弃掉上清液。加入培养液DMEM大约4 mL，反复冻融，三次即可，每次10 min。然后离心5 min转速2 000 rpm，将离心得到的病毒保存于-80 ℃冰箱中。将293A细胞分装到20个150 mm的培养皿中，用病毒感染，以获取更多的293A细胞。48 h,病毒成熟后，PBS清洗，收集细胞，离心10 min转速1 000 rpm，弃掉上清液，PBS冲洗1～2次，裂解病毒。超低温冰箱（-8 ℃）保存。

1.2.4 病毒滴度测定

根据病毒的预期滴度，准备8个无菌离心管，加入90 μL无菌培养基，取待测的病毒原液10 μL加入第一个管中，混匀后取10 μL加入第二管中，继续相同操作，直至最后一管。选取所需的细胞孔，吸去90 μL培养基，丢弃。加入90 μL稀释好的病毒溶液，培养。24 h后，加入完全培养基100 μL。48 h后，计算滴度。

1.2.5 重组腺病毒感染效率测定

3T3-L1细胞被腺病毒感染后，在荧光显微镜下观察到绿色荧光，这是被病毒所感染的细胞。将荧光显微镜和普通显微镜的检测结果进行对比，求其感染效率。

1.2.6 HEK293A细胞培养

在培养时，取出存储的细胞，放入恒温水浴锅（37 ℃）中，经过1 min，在里面的冰尚未完全融化时取出。取出后，酒精擦拭消毒，将细胞转移到培养瓶中培养。12 h后，取出细胞，显微镜观察细胞贴壁情况。待细胞覆盖培养瓶面积的80%左右时，进行消化。弃掉培养基，PBS清洗，加入胰酶吹浮细胞。消化传代后，储存备用[2]。

2 结果与分析

2.1 Ad-SFRP5 shRNA腺病毒干扰载体的鉴定

从Vector Builder购买的pAV-shRNA-EGFP和pAV-mSFRP5shRNA-EGFP载体，腺病毒重组载体中包含绿色荧光蛋白EGFP，SFRP5的干扰序列位于其CDS区的1078～1098 bp，插入载体的788～835 bp位置，干扰分值为13.2。对其进行PacI单酶切鉴定发现，Pac1酶切结果显示pAV-shRNA-EGFP和pAV-mSFRP5shRNA-EGFP载体质粒均释放一个长度为2081 bp的片段。通过测序及序列比对，发现克隆序列与插入序列完全一致，证明Ad-SFRP5 shRNA载体构建成功。

2.2 干扰载体病毒包装

通过脂质体共转染的方法分别将pAV-shRNAEGFP和pAV-mSFRP5shRNA-EGFP质粒导入HEK293A细胞中。2 d后，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达。6 d后，周围的细胞逐渐被感染，病毒开始释放，且感染面积越来越大。10 d后绿色荧光蛋白的面积进一步增加。将收集到的原始病毒继续感染HEK293A细胞，48 h后90%的地区都已被荧光蛋白覆盖，表明细胞的形态开始发生变化，开始变大，变圆。

2.3 干扰载体感染3T3-L1细胞系

3T3-L1细胞被病毒感染。48 h后，感染的3T3-L1细胞在荧光显微镜下出现绿色荧光，并且80%以上均被感染，证明Ad-SFRP5 shRNA重组腺病毒可感染细胞系。

3 讨论与结论

脂肪因子是调节机体功能的重要因子，在机体内有着不可替代作用。脂肪因子的失调会导致肥胖，动脉粥样化等疾病的发生。肥胖是由于生活方式的转变和饮食结构的转变所引起的结果，是由于体内的脂肪细胞增殖分化，引起脂肪组织的沉积。肥胖所引起的相关疾病大多是一些炎症性的疾病，会抑制某些激素的活性，机体内的一些信号通路会抑制蛋白酶的活性，干扰脂肪细胞的分化，使白色脂肪组织向棕色脂肪组织转变。SFRP5基因在维持机体的生命活动方面具有重要的作用，主要在脂肪细胞中表达，在脂肪细胞的增殖分化方面具有重要的诱导作用。同时可以抑制炎症因子的活性，抑制炎症因子或使其不表达，改善代谢性疾病，对动脉粥样化、脂质沉积等疾病的研究产生重要的影响，对疾病的治疗具有重要意义[3]。本研究通过Pacl单酶切和测序鉴定，筛选获得Ad-Scramble shRNA和Ad-SFRP5 shRNA阳性克隆。通过HEK293A细胞包装、病毒扩繁、腺病毒感染效率测定等，成功取得了所需的病毒颗粒[4]。3T3-L1细胞系被获取的病毒感染后，发现其感染效率可达80%以上。此次结果表明载体构建及病毒制备成功，为以后的试验研究打下基础。