人细胞内Ca2+对CD4+T细胞免疫功能调控作用的研究进展

麻芯茹，徐闯综述，杨威，张冰冰审校

1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319

CD4+T淋巴细胞是人体免疫系统中重要的免疫细胞之一，该细胞在清除癌变组织和癌细胞过程中具有重要意义。研究表明，单纯输注CD4+T淋巴细胞可使接种血液或实体肿瘤细胞后的动物免于发病；该研究就CD8+T和CD4+T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效果进行了比较，结果发现，CD4+T淋巴细胞具有更强的杀伤效果［1］。另外，CD4+T淋巴细胞还可激活巨噬细胞分泌IFNγ或NK细胞杀伤MHCⅡ类抗原阴性肿瘤细胞［2］。CD4+T淋巴细胞的功能取决于T细胞受体（T cell receptor，TCR），TCR的激活触发了钙从内质网释放，进而影响其细胞周期进展和增殖［3］。

1 CD4+T淋巴细胞的分化及免疫功能

CD4+T淋巴细胞可被不同刺激因子激活，并分化成相应的T细胞亚群，根据产生的细胞因子差异，活化的CD4+T淋巴细胞主要分为Th1、Th2、Th17、滤泡辅助T细胞（T follicular helper cell，Tfh）及调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）。Th1细胞可增强巨噬细胞介导的胞内病原体感染的免疫反应，介导细胞免疫应答；Th2细胞可刺激肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的活化，发挥体液免疫作用，同时介导蠕虫的免疫反应；Th17细胞主要针对细胞外细菌的免疫应答，可刺激多种细胞招募中性粒细胞至感染部位；Tfh细胞可刺激生发中心的B细胞成熟；Treg细胞可抑制免疫反应从而维持免疫稳态。免疫细胞的激活取决于钙信号，细胞内Ca2+失衡被认为是炎症诱导剂［4］。Ca2+在免疫细胞的免疫应答反应中发挥重要作用，参与调控细胞内的信号转导过程，因此细胞中的Ca2+浓度对维持免疫细胞的正常功能具有重要意义［5］。

2 钙池引发的细胞内Ca2+进入

细胞内Ca2+是最重要的第二信使，对真核细胞的多种生物学过程至关重要，如参与肌肉收缩、基因表达、突触传递、激素分泌、基因转录及细胞分裂、代谢和凝血等生理过程。机体缺血时，可通过调节Ca2+内流来影响神经元的凋亡、神经电信号传导、血小板的生物学功能、激活炎症小体等，因此，细胞内Ca2+浓度与细胞功能密切相关。正常静息状态下，细胞外Ca2+的浓度为10-3mol／L，细胞内Ca2+浓度为10-7mol／L，内质网Ca2+浓度为10-3mol／L，在细胞外空间和细胞质之间建立了巨大的Ca2+梯度（约20 000倍）。因此，即使在静止的T细胞中，Ca2+流量的动态调节也会不断发生，以维持该梯度。当T细胞被激活，细胞内Ca2+浓度持续增加，这是由内质网内Ca2+存储库的排空引起的。内质网的体积小，Ca2+储量少，细胞内Ca2+减少会导致细胞质Ca2+浓度的升高速度降低，特别是在T细胞中，细胞激活后，储存在内质网钙池中的Ca2+被释放，该过程为Ca2+释放激活Ca2+通道（Ca2+release acticated Ca2+，CRAC）产生的，CRAC通道由钙通道蛋白（calicum release activated calcium channel protein，ORAI）组成，这些ORAI具有较高的Ca2+选择性，形成通道的Ca2+渗透孔。内质网上的基质相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM）检测到TCR刺激后使内质网Ca2+存储减少，导致其构象变化和低聚，使STIM与ORAI通道并置，从而使Ca2+流入细胞，产生的Ca2+涌入称为钙库操作性Ca2+通道（storeoperated Ca2+entry，SOCE）。因此，SOCE是一个基本过程，以确保连续获得细胞外来源的Ca2+［2-7］。

内质网引发Ca2+通过SOCE调节免疫细胞，经肌浆／内质网Ca2+ATP酶（sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca-ATPase，SERCAs）将胞浆Ca2+转移回内质网，内腔Ca2+负荷传递至存储SOCE的Ca2+传感器STIM1上。STIM1通过其氨基末端结合Ca2+的内质Hand结构域来检测Ca2+存储的消耗，储存耗竭触发了通过EF-SAM区域在内质网中STIM1寡聚物的形成［8-9］，随后在内质网-质膜结合处易位至离散的“点状”，激活质膜内的Ca2+释放，打开位于质膜上的ORAI1［10-11］。由于SOCE激活对多种细胞反应较重要，必须严格控制Ca2+进入方式，防止由于Ca2+大量流入引起的细胞毒性。

STIM蛋白是内质网中的单次跨膜受体（singletransmembrane receptor），在人类中具有2个同源物，即STIM1和STIM2，均有助于维持细胞内Ca2+的浓度，STIM2对Ca2+的亲和力低于STIM1。ORAI是质膜上的Ca2+通道蛋白，包括3种类型（ORAI1～3型），在多种细胞中表达。ORAI1是重要的蛋白质之一，其功能丧失突变会导致CRAC通道失活，因此本文主要关注ORAI1蛋白质的结构基础［12］。ORAI1包含4个跨膜结构域（transmembrane domain，TM），N和C-末端均位于胞质溶胶中。STIM1通过感应到内质网中Ca2+的消耗，导致构象变化，STIM1蛋白缔合为二聚体和高阶寡聚物，并转移至内质网-质膜的连接处以激活ORAI1，该连接处被命名为STIM-ORAI激活区。研究表明，在人类中发生的ORAI1或STIM1突变、功能丧失或无效突变会导致免疫细胞（T、B和NK细胞）和非免疫细胞的SOCE功能严重受损或丧失［13］，从而导致严重的联合免疫缺陷样疾病，并伴有慢性感染、自身免疫、肌张力低下和牙齿发育的缺陷［14］。STIM1：ORAI1复合物的形成允许细胞外Ca2+进入，并促进内质网中Ca2+的再填充；内质网中Ca2+浓度的增加通过Ca2+与N-末端的结合提供了负反馈信号，减少STIM1点和SOCE的失活。

3 Ca2+信号对CD4+T淋巴细胞活化及增殖的调控作用

T细胞活化是指原始T细胞在接触抗原后转化为效应T细胞的过程。第1个关键步骤是通过抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）处理抗原，使抗原-MHC复合物在细胞表面表达，这些复合物与TCR的结合启动了复杂的活化过程，使幼稚T细胞转化为针对特定抗原的活化T细胞。STIM1是T细胞激活的关键早期效应蛋白，通过影响Ca2+的水平来调节免疫细胞的活化［15］。幼稚CD4+T淋巴细胞表达ORAI1、2和3，效应子淋巴细胞则主要表达ORAI1，研究显示，敲除小鼠T细胞或人T细胞中的ORAI1基因会减弱细胞中的Ca2+内流，并严重阻碍小鼠或人的适应性免疫应答［16］。在T细胞的阳性选择期间，细胞内Ca2+浓度有较大变化［17］，在T细胞阴性选择时，细胞内会有大量Ca2+流入，若抑制细胞外Ca2+的内流则T细胞阴性选择受阻［18］。有研究显示，CRAC通道介导的Ca2+内流可调控T细胞内炎症因子和趋化因子的表达［19］。

在CD4+T淋巴细胞中，抗原通过识别TCR诱导许多信号级联反应和T细胞内的分子重新排列共同控制免疫反应，CRAC通道在TCR反应后被激活，从而激活磷脂酶C，磷脂酶C再介导肌醇1，4，5-三磷酸（InsP3）的生成。InsP3在胞质内迅速扩散，并与位于内质网的InsP3受体结合，该受体作为Ca2+通道，允许存储在内质网腔内的Ca2+耗尽。从内质网中排空的Ca2+通过缓慢激活存储操作的Ca2+通道，触发外部Ca2+进入细胞。否则内质网内Ca2+的释放不足以维持细胞内Ca2+的水平、细胞因子的产生及T细胞的活化［20］。TCR诱导的Ca2+升高激活了钙调磷酸酶，磷酸酶将磷酸化转录因子NFAT磷酸化，进入细胞核内，使其发生易位与其靶基因结合。ORAI1或STIM1无效突变患者T细胞缺乏SOCE和IL-2的产生。IL-2为T细胞自分泌和旁分泌生长因子，可促进T细胞分化为明确的效应T细胞亚群［21］。

另外，钙信号转导还参与SOCE控制T细胞增殖和细胞周期，SOCE和钙调神经磷酸酶通过代谢重编控制TCR诱导T细胞增殖。Ca2+和钙调神经磷酸酶通过控制IL-2的产生或促进细胞周期的进展来调节T细胞增殖。

4 Ca2+信号对Th17／Treg细胞免疫功能的调控作用

近年研究证实，炎症与人类肥胖、高血压、血脂紊乱等多种代谢综合征密切相关，其中Th17／Treg细胞及其相关细胞因子在代谢综合征所致炎症中作用机制成为研究热点。Th17和Treg细胞在炎性疾病发展中有相反作用，两者的平衡对免疫稳态至关重要。在分化方面，IL-6与TGF-β可协同诱导Th17／Treg细胞的分化［22］，正常情况下TGF-β诱导初始CD4+T细胞叉头样转录因子3（forkhead transcription factor p 3，Foxp3）表达，进而分化为Treg细胞；IL-6则抑制Foxp3表达，介导信号传导与活化转录因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）磷酸化，进而诱导维甲酸相关孤核受体γt（retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt）的表达和Th17分化，从而诱导以Th17为主的慢性炎性应答。另外，IL-21也可抑制TGF-β诱导Foxp3的表达，并与TGF-β共同在初始CD4+T细胞诱导分化Th17中发挥重要作用。活化的Th17细胞通过STAT3信号分泌促炎因子IL-17、IL-6、IL-21及TNF-α等，可促进中性粒细胞、树突状细胞的增殖、成熟及趋化过程，诱导炎症反应及自身免疫性疾病发生。Th17细胞还具有屏障保护作用，尤其在肠道中，Th17细胞可调节宿主对微生物群的反应并维持肠道稳态［23］。Th17细胞参与了多种炎性疾病，如多发性硬化症、炎性肠病、类风湿性关节炎和牛皮癣的致病机制［24］。过量的Th17细胞会引发严重的自体免疫疾病，钙信号传导通过调节线粒体功能来控制致病性Th17细胞介导的炎症［25］。Treg可产生TGF-β和表达转录因子Foxp3，Treg细胞通过与细胞接触和分泌抑制细胞因子如IL-10、TGF-β，IL-10与TGF-β 抑制炎症因子的合成与释放，从而起到抗炎的作用，表现出免疫抑制和自身免疫耐受功能［26］，在维持机体免疫平衡和自身耐受中发挥重要作用。Treg细胞负责调节免疫系统，保持对自身抗原的耐受性，预防自身免疫性疾病，Treg细胞可通过多种机制抑制效应T细胞增殖和细胞因子的产生，从而在限制免疫介导的炎症反应中发挥重要作用［27］。Treg细胞参与了自身或非自身抗原引起的免疫反应负调控，如肿瘤免疫、器官移植、过敏和微生物免疫等［28］。

RORγt及FoxP3分别为Th17和Treg细胞的特异性转录因子，高浓度的TGF-β在幼稚CD4+T细胞中可诱导FoxP3表达，促使其分化为Treg细胞［16］。相反，TGF-β和IL-6增加STAT3-RORγt的信号转导，从而促进Th17细胞分化［29］。STAT3对Th17的发育具有重要作用，已证明其可抑制Foxp3的表达，而Foxp3能够结合Th17细胞中重要转录因子R ORγt，并抑制其转录活性，从而抑制初始T淋巴细胞向Th17细胞方向分化［30］。具有促炎作用的Th17细胞和具有免疫抑制作用的Treg细胞在功能上相互制约并存在动态平衡［31］，该平衡与肝炎、肺炎、肿瘤、移植等密切相关［32-35］。Ca2+内流导致肿瘤来源的外来体（tumor derived exosome，TEXE）选择性激活人Treg细胞［36］，SOCE可激活多种Ca2+依赖性酶和转录因子，包括磷酸酶钙调神经磷酸酶活化T细胞的核因子（nuclear factor of the activated T cell，NFAT），NFAT可调节许多细胞因子基因的转录，包括IL-17A、IL-21、IL-22和IFNg［37］。通过抑制STIM1减弱Th17细胞内Ca2+流入可显著降低活化Th17细胞的STAT3表达，从而显著降低其致炎性，但NFAT和STAT3在Th17细胞中的直接调控机制尚未明确。另外，抑制STIM1可导致Th17细胞中线粒体功能受损、降低氧化磷酸化相关基因的表达［38］及提高细胞内活性氧（reactive oxygen stke，ROS）水平，表明Ca2+内流是Th17细胞介导的多器官炎症中线粒体功能和氧化应激的关键调节 剂［39-40］。有报道指出，SOCE介导的细胞内Ca2+升高还可活化NADPH氧化酶，促进线粒体脂肪酸氧化［41-42］。

5 小结

Ca2+作为细胞内重要的第二信使，在细胞的各种生理及病理活动中发挥着重要作用，与CD4+T细胞活化、增殖和免疫功能密切相关。目前已明确CD4+T淋巴细胞与脂肪肝、肝脂沉积、肝炎、肿瘤等多种疾病的发生发展有关，深入研究细胞内Ca2+对CD4+T免疫功能调控机制，将对多项临床疾病新治疗方案的深入研究起到关键作用。