青花椒精油纳米乳的制备及其体外抑菌活性研究

靳若宁，钱雪，赵孔发，傅雷，陈斌，苟仕坤，唐硕，黄晓德*，张锋伦**

（1.南京师范大学，江苏 南京210023；2.南京野生植物综合利用研究所，江苏 南京 211111；3.江苏省天然香料工程技术中心，江苏 南京 211111；4.昭通市大成农业开发有限责任公司，云南 昭通 657100）

青花椒（Pericarpium Zanthoxyli）为芸香科青花椒属植物，成熟果皮富含挥发油，广泛应用于香料和油料［1］，通常分布在亚非等热带和亚热带地区。我国目前约有50种该属植物，以南部各省区尤其是四川西南地区为主，著名产地有四川汉源、云南谷律、河南东岗和陕西凤县［2-3］。目前，对青花椒的研究主要是对其果皮、叶和籽及其生物活性的研究［4-5］。

精油是植物通过次生代谢产生的物质，其分子量小，易挥发，通常具有独特气味［6］。中药外用制剂中使用精油可促进处方中其他成分透皮吸收，发挥“药辅合一”的作用［7］。青花椒精油是从青花椒果壳中提取而来的，具有一定挥发性的小分子量精油类物质，主要被用于在食品在医药和工业方面［3］。迄今为止的研究发现，青花椒精油对一些常见菌株如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制作用，对酵母、青霉和黑曲霉等也有很好的抑菌效果［8］。但青花椒精油存在一些诸如与基质相容性差导致溶解度低和不稳定的特性导致的易挥发、不易储存等问题，致使其应用受到了限制［9］。针对这种情况，当今采用的解决方式通常为将其制备为黏附性，及生物相容性均较好的凝胶剂［10］。纳米乳主要由油、水、表面活性剂和助表面活性剂组成，其粒径一般在10～100 nm区间，是一种功能性良好的胶体分散体系［11］。以纳米乳的形式对植物精油加工，包载后的精油纳米乳质量稳定，具有易贮藏、不易挥发、可长久留香和功效持久等优点［12］。

自20世纪以来，对青花椒精油的提取利用的研究逐步开展，与此同时将植物精油制备成不同载药体系的研究也越来越多，但目前对青花椒精油纳米乳的研究相对较少，仍有许多值得进一步深入的空间。因此，为了有效提高青花椒精油的稳定性和生物利用度，本试验以青花椒精油为主要药物成分和油相，采用相转变法制备青花椒精油纳米乳，伪三相图法筛选最优表面活性剂和助表面活性剂，得到最优配方，并考察纳米乳理化性质和抑菌活性，为青花椒精油的开发利用提供基础。

1 材料与试剂

1.1 材料

青花椒精油、大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由南京野生植物综合利用研究院提供。

1.2 试剂

蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、氢化蓖麻油（CO-40）、1，2-丙二醇和丙三醇，山东优索化工科技有限公司产品；吐温-80（Tween-80），南京古田化工有限公司；聚乙二醇-400（PEG-400），国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水；分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器

BSA423S电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪（英国Malvern公司）；Tecnai 12透射电子显微镜（荷兰Philips公司）；FE 28 pH计（梅特勒-托力多仪器（上海）有限公司）。

2 试验方法

2.1 青花椒精油纳米乳的制备

2.1.1 表面活性剂和助表面活性剂的选择

在本研究中，选择乳化效果较好的EL-40、CO-40和Tween-80作为表面活性剂，选择毒性和副作用都较小的1，2-丙二醇、丙三醇、PEG-400和无水乙醇作为助表面活性剂。

参考袁珍珍等［13］制备杜香油纳米乳的方法，将表面活性剂与助表面活性剂的质量比设置为3：1，混匀后得到三种表面活性剂分别与四种助表面活性剂组成的共计12种表面活性剂-助表面活性剂组合。再以青花椒精油为油相，将表面活性剂-助表面活性剂组合与精油质量比设定为8：2，搅匀后边震荡边用蒸馏水滴定，观察这12种组合是否有澄清透明的纳米乳形成。再将筛选好的表面活性剂-助表面活性剂组合与精油质量比分别设置成9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8和1：9混合，均匀后边震荡边用蒸馏水滴定，观察是否有澄清透明的纳米乳形成，并运用伪三元相图筛选最佳的表面活性剂-助表面活性剂组合。

2.1.2 Km值的确定

将已筛选出的表面活性剂与助表面活性剂分别按质量比为1：1、2：1、3：1、4：1混匀，再与青花椒精油按质量比为9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9混合均匀，边振荡边使用蒸馏水滴定，对形成的纳米乳观察时以澄清、透明、黏度适中、没有浊光为指标，选择最佳Km值。

2.1.3 青花椒精油纳米乳配方的优化

将选定的表面活性剂、助表面活性剂按最佳Km值混合，然后再对表面活性剂-助表面活性剂组合与精油分别以质量比9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9混匀，于室温下搅拌，同时逐滴滴加青花椒精油，观察稳定性情况并确定各组分的质量分数百分比。

2.2 青花椒精油纳米乳的质量评价

2.2.1 纳米乳结构类型的鉴定

使用染色法判断该纳米乳是油包水（W/O）型还是水包油（O/W）型［14］。加入苏丹红（红色）和亚甲蓝（蓝色），观察两者扩散的速度，若红色扩散速度快，则为油包水（W/O）型；若蓝色扩散速度快，则为水包油（O/W）型［15］。

2.2.2 pH值的检测

取适量自制最佳配比的青花椒精油纳米乳，用pH计测试其pH值，平行测定三次。

2.2.3 粒径分布、多分散性系数和电位分布的检测

各取1 mL青花椒精油纳米乳装入两种不同的比色皿中，使用粒度分析仪检测青花椒精油纳米乳的粒径分布、多分散性系数和电位分布。

2.2.4 微观形态观察

取适量纳米乳滴在铜网上，待自然干燥后滴加2%磷钨酸溶液，负染一定时间直至干燥后用透射电子显微镜观察。

2.3 青花椒精油纳米乳抑菌活性的检测

2.3.1 青花椒精油纳米乳对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）

利用二倍稀释法可以得到青花椒精油纳米乳对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值。将青花椒精油纳米乳在96孔板内使用培养基连续稀释，然后分别加入大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液培养24 h，观察细菌生长情况。试验组每组重复3次，同时设置两组对照，对照组1为未加纳米乳只加入培养基和菌液，对照组2为未加菌液只加入纳米乳和培养基。肉眼观察试验组和对照组进行比较，将培养基清亮且未见细菌生长时的最低浓度判定为该药物的最低抑菌浓度［16］。

2.3.2 微生物生长曲线测定

本试验采用比浊法测定，该法简捷迅速，可以连续测定，常用于大肠杆菌等微生物生长曲线的测定［17，26］。将青花椒精油和青花椒精油纳米乳在96孔板内使用培养基连续稀释，然后分别加入大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液培养，观察细菌生长情况。试验组每组重复3次，同时设置对照组为未加纳米乳只加入培养基和菌液。利用分光光度计分别测定细菌悬液在0、1、2、4、8、12、24 h的光密度，并将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培养时间作图，绘制两种菌液在不同条件下的生长曲线。

3 试验结果与分析

3.1 青花椒精油纳米乳的制备

3.1.1 表面活性剂和助表面活性剂的选择

以EL-40为表面活性剂时，四种促表面活性剂1，2-丙二醇、丙三醇、PEG-400和无水乙醇均能形成澄清透明的纳米乳；以CO-40为表面活性剂时，促表面活性剂中1，2-丙二醇和无水乙醇均能形成澄清透明的纳米乳；以Tween-80为表面活性剂时，这四种促表面活性剂则均不能制得纳米乳，结果见表1。如表1所示，当表面活性剂为EL-40时可与更多种类的促表面活性剂形成组合包载精油形成青花椒精油纳米乳，且形成的纳米乳性状更好，因此选择EL-40作为纳米乳的表面活性剂。

表1 青花椒精油纳米乳的形成情况Tab.1 Formation of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

在四种促表面活性剂1，2-丙二醇、丙三醇、PEG-400和无水乙醇中，1，2-丙二醇、PEG-400和无水乙醇与EL-40的组合形成的纳米乳性状优于EL-40。此外，乐薇等［18］在对梅青花椒挥发油的分析时发现，无水乙醇虽然在纳米乳的形成中性状表现良好，但其溶解范围广、提取特异性低，因此EL-40与无水乙醇的搭配不在考虑内。

结果表明，在固定Km为3：1的前提下，以1，2-丙二醇为助表面活性剂时，表面活性剂-促表面活性剂组合与精油质量比为9：1～6：4时可形成纳米乳。以PEG-400为助表面活性剂时，表面活性剂-促表面活性剂组合与精油质量比为9：1～7：3时可形成纳米乳，结果见图1。当选择1，2-丙二醇作为助表面活性剂时形成的纳米乳区域面积更大，因此选择1，2-丙二醇作为纳米乳的助表面活性剂。

图1 不同助表面活性剂制备青花椒精油纳米乳的伪三元相图Fig.1 Pseudo-ternary phase diagrams of Zanthoxylum essential oil nanoemulsions prepared with different cosurfactants

3.1.2 Km值的确定

Km值结果表明，当Km为1：1时，表面活性剂-促表面活性剂组合与精油质量比为9：1～8：2可形成纳米乳；当Km为2：1时，表面活性剂-促表面活性剂组合与精油质量比为9：1～7：3可形成纳米乳；当Km为3：1时，表面活性剂-促表面活性剂组合与精油质量比为9：1～6：4可形成纳米乳；当Km为4：1时，表面活性剂-促表面活性剂组合与精油质量比为9：1～7：3可形成纳米乳。通过绘制伪三元相图分析，如图2所示，与Km为1：1、2：1和4：1形成的乳区面积相比，Km为3：1时形成的纳米乳区域面积更大。因此，选择Km为3：1作为表面活性剂与助表面活性剂质量比。

图2 Km为1：1、2：1、3：1和4：1制备青花椒精油纳米乳的伪三元相图Fig.2 Pseudo-ternary phase diagrams of Zanthoxylum essential oil nanoemulsions prepared with Km of 1：1、2：1，3：1 and 4：1

3.1.3 青花椒精油纳米乳配方的优化

见表2，结果表明，当Km为3：1，表面活性剂-促表面活性剂组合与青花椒精油质量比在9：1、8：2、7：3、6：4时都可以形成澄清透明的纳米乳。但当表面活性剂-促表面活性剂组合与青花椒精油质量为6：4时形成的青花椒油纳米乳性状相对较差，故不作选择。此外，制备青花椒精油纳米乳时应尽量提高载药量，故选定质量比7：3作为纳米乳中表面活性剂-促表面活性剂组合与青花椒油比例。

表2 青花椒精油纳米乳外观性质情况Tab.2 Appearance and properties of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

综合前面筛选的结果，可以确定青花椒精油纳米乳最佳配方为：12.63%蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、4.21%1，2-丙二醇、7.33%青花椒精油、75.82%蒸馏水。按上述配方和制备方法制备的青花椒精油纳米乳澄清、透明、流动性好，无分层现象。

3.2 青花椒纳米乳的质量评价

3.2.1 纳米乳结构类型的鉴定

判断纳米乳结构的染色结果显示，在青花椒精油纳米乳中蓝色染剂扩散速度更快，该纳米乳为水包油（O/W）型。

3.2.2 pH值的检测

结果表明，本试验制备得到的青花椒精油纳米乳pH值为5.12±0.09，性质相对安全、温和。

3.2.3 粒径分布及多分散系数和电位分布的检测

激光粒度分析仪测定纳米乳的粒径电位大小及分布，结果如图3和图4所示，纳米乳平均粒径为126.1±0.78 nm，分散指数为0.591±0.21，电位为0.15±4.06 mV，呈正态分布。本试验制备得到的青花椒精油纳米乳粒径大小与常规纳米乳粒径近似，质量良好。

图3 青花椒精油纳米乳的粒径分布图Fig.3 The particle size distribution of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

图4 青花椒精油纳米乳的电位分布图Fig.4 Potential distribution diagram of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

3.2.4 微观形态观察

见图5，透射电子显微镜下观察到青花椒精油纳米乳整体呈球形，分布较为均匀。

图5 青花椒精油纳米乳的透射电镜图Fig.5 Transmission electron micrograph of Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

3.3 青花椒精油纳米乳抑菌活性的检测

3.3.1 青花椒精油纳米乳对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度

青花椒精油纳米乳对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值均为2.29 mg/ml，但与青花椒精油对两种菌种的抑制效果相比，青花椒精油纳米乳对大肠杆菌的抑菌活性的提升大于对金黄色葡萄球菌的提升，结果见表3。

表3 青花椒精油和青花椒精油纳米乳对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MICTab.3 MIC of Zanthoxylum essential oil and Zanthoxylum essential oil nanoemulsion against E.coli and S.aureus

3.3.2 微生物生长曲线测定

植物精油存在一些诸如与基质相容性差导致溶解度低和不稳定的特性导致的易挥发、不易储存等问题，致使其应用受到了限制。青花椒精油的主要成分柠檬烯、芳樟醇、β-蒎烯和乙酸芳樟酯可抑制多种供试菌株如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长［19］。纳米乳中的小脂质颗粒能够促进精油与细胞膜紧密接触，从而增强精油的抑菌能力［20］。如图6-7所示，与青花椒精油相比，青花椒精油纳米乳对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有更显著的抑菌效果，这表明本文制备的青花椒精油纳米乳抑菌效果良好，可以增强青花椒精油的抑菌活性。

图6 青花椒精油纳米乳对两种菌种的生长抑制Fig 6 Growth inhibition of two strains treated with Zanthoxylum essential oil nanoemulsion

图7 青花椒精油和青花椒精油纳米乳对两种菌种的生长抑制比较Fig 7 Comparison of the growth inhibition of Zanthoxylum essential oil and Zanthoxylum essential oil nanoemulsion on two strains

4 讨论

纳米乳主要由油、水、表面活性剂和助表面活性剂组成，能有效改善精油单独作用时不稳定、易挥发的缺点。本试验以青花椒精油为油相，采用形成乳区面积最大的EL-40和1，2-丙二醇作为表面活性剂和助表面活性剂，再结合伪三相图法筛选各组成部分的最佳配比，最终确定了制备青花椒精油纳米乳的最优配方为：12.63%蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、4.21% 1，2-丙二醇、7.33%青花椒精油和75.82%蒸馏水。根据此配方制备的纳米乳整体澄清且稳定性良好，其纳米乳平均粒径为126.1±0.78 nm，分散指数为0.591±0.21，呈正态分布，透射电子显微镜下观测到的纳米乳形态呈均匀分布的球形。对本研究制备的青花椒精油纳米乳进行的抑菌实验证明，与青花椒精油相比，青花椒精油纳米乳对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果更强。本试验通过筛选最佳的青花椒精油纳米乳配方，有效地解决了青花椒精油本身存的溶解度低、不稳定和不易储存等问题，为今后青花椒精油的进一步利用提供了理论依据。