不同时期白花前胡内生菌的多样性和差异性

罗书岚，刘丽，李肖莉，宋程，贾彬，欧金梅，韩邦兴1，**

（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230038；2.皖西学院生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；3.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012）

伞形科植物白花前胡（Peucedanum praeruptorumDunn）是中国药典规定的中药前胡的唯一来源，具有降气化痰、散风清热的功效［1］。近期的药理学研究表明，白花前胡根提取物具有一定的抗非小细胞肺癌作用［2］，白花前胡乙素能一定程度抑制卵巢癌细胞的增长［3］。白花前胡药材抽薹前与抽薹后的药材品质差异大，多以抽薹前白花前胡入药［4］。在传统栽培过程中，第一年播种出苗后进入营养生长，根部肉质肥厚，当年秋、冬季节采挖，可做药材，而白花前胡早期抽薹后，植物根部组织结构活性成分含量发生变化，对白花前胡药材的质量和产量都有很大程度的影响［5］。目前，对于抽薹后的白花前胡药用价值降低的机理还不够明确，原因可能是抽薹后的白花前胡其生长重心是地上部分，白花前胡叶和花的发育需要消耗大部分的营养物质［6］。

近年来植物内生菌的研究越来越多，内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段，生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌或真菌［7］。药用植物内生菌与宿主在长期进化的过程中，可能有与宿主相同的次生代谢产物合成途径，产生和宿主相同或者相似的药用活性代谢产物［8］。植物次生代谢产物的变化一定程度上受植物内生菌多样性和差异性的影响。

目前，关于白花前胡抽薹前、抽薹后及开花期的内生菌的研究尚未见报道，本研究运用宏基因组学的方法以两年生的白花前胡抽薹前后及开花期的内生细菌和真菌为研究对象，系统的研究抽薹前、抽薹后及开花期白花前胡内生菌群落多样性和差异性，丰富了白花前胡内生细菌和内生真菌的种类与资源。

1 材料和方法

1.1 试验样品

白花前胡样本来自安徽省六安市金安区东河口，由皖西学院生物与制药工程学院韩邦兴教授鉴定。取两年生的白花前胡抽薹前样品（CTQ2），抽薹后样品（CTH2），开花期样品（CTF2）为研究对象。

1.2 样品消毒

样品消毒方法参考王菅［9］等的方法，将白花前胡植株表面用自来水冲洗干净并放于超净工作台内晾干。将白花前胡根剪切分离，并对根的表面进行消毒处理：在0.1%升汞中放置3 min；用无菌水漂洗3次；置于75%的乙醇中浸泡3 min；无菌水漂洗6次；最后用无菌纸擦干表面的水分。将最后一次漂洗的无菌水于室温避光在培养基上培养一个星期，观察是否长菌，以此验证表面消毒是否有效。

1.3 样品宏基因组测序

用OMEGA试剂盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取DNA，并用琼脂糖凝胶和Qubit3.0 DNA检测试剂盒检测DNA的完整性并对其进行精确定量。PCR所用的引物融合了Miseq测序平台的V3-V4通用引物及ITS1-2通用引物。15 μL的2×Taq Master Mix、10 μΜBar-PCR primer F和Primer R各1 μL、Genomic DNA10～20 ng，加去离子水到30 μL作为反应体系，然后进行PCR扩增。使用Illumina MiSeqTM平台进行测序。

1.4 数据处理与统计分析

每个样本有效数据是从Illumina MiseqTM序列抽取序列得到的，使用Usearch去除预处理后序列中的非放大区域序列，对序列进行序列错误修正。此外，通过blastn将去嵌合体序列与数据库的代表序列进行比较，将比阈值低的比较结果作为目标区域外序列。通过Usearch将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类，基于序列之间97%的相似性将序列分割成不同的操作分类单元（Operational taxonomic units，OTU），并进行各种OTU分析。使用R的Venn Diagram包 创 建Venn图，Shannon指 数 通 过Mothur计算，样品和群落分布信息在R的gplots包中同时被聚类并显示在heatmap上，使用线性判别分析及影响因子（Linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析显示白花前胡内生菌中的差异菌。

2 结果与分析

2.1 物种组成（OTU）分析

在97%相似性聚类分析后，3组样品中共鉴定出2 624个细菌OTUs，其中CTQ2，CTH2，CTF2样品中内生细菌物种OTU数分别为1 060，1 292，846，3组样品共有OTU数为115，占总OTU数 的4.38%；与其他2组样品相比，CTH2包含的OTU数最多，独有的OTU数也最多。3组样品中，CTF2的OTU数 最 少，CTH2的OTU数 最 多，见 图1a。3组样品中共鉴定出4 281个真菌OTUs，CTQ2，CTH2，CTF2样品中内生真菌物种OTU数分别为2 066，2 016，1 520，3组样品共有OTU数为312个，占总OTU数的7.29%；CTF2拥有的OTU数在3组样品中最少，独有的OTU数也最少，见图1b。综上，抽薹前、抽薹后及开花期的白花前胡内生菌存在差异，白花前胡中内生细菌OTU数比内生真菌OTU数少，且共有OTU数白花前胡内生细菌比例小。

图1 白花前胡植株内生菌物种（OTUs）组成的Venn图Fig.1 Venn diagram of endophytes（OTUs）in Peucedanum praeruptorum Dunn

2.2 多样性分析

基于OTU丰富度，用Shannon多样性指数分析白花前胡样本中的微生物多样性（见图2），发现3组样品多样性存在一定差异。CTF2的内生细菌多样性指数显著高于CTQ2（P＜0.05），而3组样品的内生真菌无显著差异（P＞0.05）。

图2 内生菌群Alpha多样性评价Fig.2 Alpha diversity estimates of the endophytic communities

2.3 优势菌和差异菌

变形菌门（Proteobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes）广泛存在于CTQ2、CTH2和CTF2的白花前胡中，疣微菌门（Verrucomicrobia）广泛存在于CTQ2与CTH2中，为优势菌门。在属水平上，假单胞菌属（Pseudomonas）、伯克霍尔德菌（Burkholderia）、Povalibacter为主要优势细菌属，从聚类结果看，CTH2，CTF2聚为一类后再与CTQ2聚为一类，见图3a。

子囊菌门（Ascomycota）等真菌广泛存在于CTQ2、CTH2和CTF2的白花前胡；在属水平上，前胡CTQ2、CTH2的瓶霉属（Phialophora），小球腔菌属（Leptosphaeria）丰度显著高于CTF2。从聚类结果看，与内生细菌不同的是CTQ2，CTH2聚为一类后再与CTF2聚为一类，见图3b。

图3 不同生长时期白花前胡内生菌在属水平的丰度Heatmap图Fig.3 Heatmap of endophytes in Peucedanum praeruptorum Dunn at genus level in different growth stages.

根据不同生长时期白花前胡内生菌LEfSe分析发现，前胡CTQ2，CTH2及CTF2内生细菌共有32个差异丰富的分类学分支，内生真菌有29个差异丰富的分类学分支（a＝0.01，LDA≥2.0）。在属水平上，白花前胡CTF2显著高于其他时期的内生细菌有假单胞菌属（Pseudomonas），Dokdonella，而内生真菌仅有蜡壳耳目（Sebacinales）和口蘑科（Tricholomataceae）；CTH2显著高于其他时期的内生细菌有Erwinia，土地杆菌属（Pedobacter），Limnobacter，Duganella，Mucilaginibacter，玫瑰色半光合菌属（Roseateles），球衣菌属（Sphaerotilus），马赛菌属（Massilia），Noviher-baspirillum，噬几丁质菌属（Chitinophaga），寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），内生真菌有小球腔菌属（Leptosphaeria），亚隔孢壳属（Didymella），背芽突霉属（Cadophora），镰刀菌属（Fusarium），短梗蠕孢属（Trichocladium），Plectosphaerella，Knufia；CTQ2显著高于其他时期的内生细菌有Citrobacter，环丝菌属（Brochothrix）和Mycoplasma，内生真菌有丛格孢属（Berkleasmium），见图4。.

图4 不同生长时期白花前胡内生菌LEfSe分析图Fig.4 LEfSe analysis of endophytes in Peucedanum praeruptorum Dunn at different growth stages.

3 讨论与结论

本研究结果表明药用植物内生菌可能是影响中药材质量的一个重要因素，内生菌的组成受到包括环境因素［10-11］、季节因素［12-13］、生长时期［14］等条件的影响。在本研究中，CTF2的内生细菌多样性指数显著高于CTQ2，CTQ2显著高于其他时期的内生细菌菌属有3个，内生真菌菌属有1个，CTH2显著高于其他时期的内生细菌菌属有11个，内生真菌菌属有7个，CTF2显著高于其他时期的内生细菌菌属有2个，表明了抽薹可能是影响白花前胡内生菌多样性与差异性的一个影响因素。本研究发现假单胞菌属（Pseudomonas）、伯克霍尔德菌（Burkholderia）、Povalibacter为主要优势细菌属，前胡CTQ2、CTH2及CTF2内生细菌共有32个差异丰富的分类学分支，而内生真菌有29个差异丰富的分类学分支（a＝0.01，LDA≥2.0），本研究结果对白花前胡内生细菌和内生真菌的种类与资源进行了丰富，填补了白花前胡抽薹前、抽薹后及开花期内生菌的研究空白。后续试验将进一步对抽薹前、抽薹后及开花期的白花前胡内生菌进行深入研究并对优势菌进行探索，为解析白花前胡抽薹后不适于药用的机理提供一定的科学依据。