基于斑马鱼生物模型的黄芩靶向降糖作用评价

刘 均，李 强，谭 蓉

中华全国供销合作总社 杭州茶叶研究院/浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江 杭州 310016

黄芩（Scutellaria barbara，SB）为唇形科黄芩属植物，始载于《神农本草经》，是常用大宗中药材。SB根部可入药，具有清热燥湿、泻火解毒、止血和安胎等功效。SB其它部位，如利用SB叶开发的“黄芩茶”可作代茶饮，已有近千年的历史。SB叶具有较好的利用价值和发展潜力越来越引起人们的关注。但是，相对SB丰富的资源量来说，目前SB叶资源的利用率较低，而且对SB叶缺乏系统质量评价研究，限制了SB产业综合价值的提升。

斑马鱼（Zebra fish）是一种脊椎模式生物，与人类基因的相似度达87%，而且由于其养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育及胚体透明，已成为生命科学研究的新宠。利用斑马鱼可以构建人类各种疾病和肿瘤模型开展靶向药物筛选及安全与毒理评价研究，如糖尿病[1-2]、高血脂[3-4]、高尿酸症[5-6]及失眠[7-8]等。本试验以斑马鱼（5 days post fertilization，5 dpf）为对象，系统研究了不同浓度、不同孵育时间下斑马鱼对SB耐受性的影响，以及SB靶向降糖功效评价，试验结果可为SB叶开发黄芩茶及SB健康功能食品的开发等提供基础理论和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器及试剂

全自动智能型生化（霉菌）培养箱，天津市宏诺仪器有限公司；酶标仪（Multiskan SkyHigh），赛默飞世尔科技(中国)有限公司；精密电子天平（AL-204），梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；离心机（3K1S），德国sigma离心机公司；手持式高速匀浆机（MY-20），上海净信实业发展有限公司；水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。SB，滦平县济世中药材种子繁育限公司；阿卡波糖（Acarbose，ACA），拜耳医药保健有限公司；ALX（CAS号：2244-11-3，纯度≥98%）；葡萄糖（glucose，GLU），国药集团化学试剂有限公司；GLU检测试剂盒（葡萄糖氧化酶法），南京建成生物工程研究所。

1.1.2 试验动物

斑马鱼（3月龄，AB型），上海费曦生物科技有限公司。斑马鱼胚胎繁殖以自然交配方式进行。每个产卵盒中按1∶1放入公鱼和母鱼，放入28.5℃恒温培养箱中。采用光周期为14 h光照与10 h黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和粪便，清洗后换孵育水（60 µg/mL，海盐水），置于28.5℃恒温培养箱中恒温孵育，每24 h换水一次，去掉卵膜和死卵。试验完成后，用三卡因甲磺酸对暴露斑马鱼麻醉处死。

1.2 试验方法

1.2.1 斑马鱼对Scutellaria barbara（SB）的耐受性试验

选取发育正常的 4 dpf（days post fertilization）野生型AB系斑马鱼随机分组，每组设3个重复，每个重复15条，分别给予（0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000）μg/mL SB溶液（以生药量计），分别记为 T0 ～ T10000，每孔加药物 5 mL，置于 28.5℃培养箱中培养。每24 h换水一次，记录每孔斑马鱼幼鱼死亡数量，计算每组死亡率。以24 h为基准，利用SPSS 17.0软件中Regression中PROBIT程序计算其LC50，并利用Graphpad Prism 软件中Analyze Data 中 XY analysis 中Linear regression 分析。

1.2.2 SB对高糖诱导斑马鱼GLU值影响试验

选取发育正常的4 dpf野生型AB系斑马鱼随机分组，每组设3个重复，每个重复15条，分别给予 0 mg/ml GLU+0 μg/mL SB、10 mg/mL GLU+0 μg/mL SB、10 mg/mL GLU+200 μg/mL SB、10 mg/mL GLU+400 μg/mL SB 和 10 mg/mL GLU+800 μg/mL SB 溶液，分别记为 NC1、NC2、T1-200SB、T2-400SB和T3-800SB，每孔加药物5 mL，置于28.5℃培养箱中培养24 h，每孔取10条鱼于1.5 mL离心管中冷冻保存用于测定GLU含量。

1.2.3 SB对糖尿病斑马鱼GLU值影响试验

选取发育正常的4 dpf野生型AB系斑马鱼给予 10 mg/mL GLU+25 μM ALX 联合孵育 24 h以诱导糖尿病模型，随后将糖尿病斑马鱼随机分组，每组设3个重复，每个重复15条，分别给予10 mg/mL GLU 与 0、200、400 和 800 μg/mL SB 或 400 μg/mL ACA联合孵育24 h，并分别记为MC、T-200SB、T-400SB、T-800SB和T-400ACA。同步设置纯水和10 mg/mL GLU组作为空白对照和高糖诱导对照组，分别记为NC1和NC2。试验结束后，每孔取10鱼条于1.5 mL离心管中冷冻保存用于测定GLU含量。

1.3 检测方法

GLU含量检测按如下步骤进行：取100 μL磷酸缓冲盐溶液于装鱼的1.5 mL离心管中，采用高速手持式匀浆机匀浆1 min至鱼体组织裂解充分，于 4℃下以 2 500 r/s离心 10 min，取上清样2.5 μL采用GLU检测试剂盒（GLU氧化酶法）测定GLU浓度，其测定程序和方法按照试剂盒说明书规定进行。

1.4 统计分析

所有试验数据经Excel 2016初步处理后，用 Graphpad Prism 6.0 绘图，并用 SPSS Statistics 17.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），所有数据均以平均值±标准差呈现；差异显著性采用Duncan分析并将进行多重比较，p＜ 0.05表示组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 斑马鱼对SB的耐受性

从图1可看出，斑马鱼幼鱼对高浓度SB溶液具有不耐受性。SB浓度大于等于8000 μg/mL时，仅孵育24 h死亡率达到69.44%。另外，从孵育时间上看，随着孵育时间的延长死亡率不断增加，尤其是 SB 剂量浓度为50 ～ 2 000 μg/mL，孵育72 h至120 h时致死作用明显增强。以48 h基准，采用SPSS中PROBIT程序分析得出斑马鱼幼鱼的SB耐受性（表1），死亡率与SB浓度间的关系为 Probit（p）= -2.047000+0.000443X，按该模型计算得出SB的LC50为4 621.832 μg/mL，95% 可信范围为 4 031.335 ～ 5 376.152 μg/mL。采用Graphpad Prism线性回归分析得出斑马鱼幼鱼的SB耐受性（图2），死亡率（%）与SB浓度（μg/ml）间的关系为y=0.01050x-1.261（R2=0.9546），按该模型计算得出SB的LC50为4 882 μg/mL，正好处于Probit模型95%可信区间内。可见，若按照10% ～ 25% LC50剂量浓度设置药物处理组，孵育48 h可选用SB的适宜剂量浓度范围为 462.18 ～ 1 155.46 μg/mL。

图1 不同黄芩浓度及孵育时间对斑马鱼幼鱼死亡率的影响Figure 1 Effects of different concentrations of Scutellaria barbara and its incubation time on the lethality rate of zebra fish larvae

表1 斑马鱼幼鱼对黄芩耐受性影响的参数估计表Table 1 Parameter estimates of SB tolerance in zebra fish larvae

图2 不同黄芩浓度对斑马鱼幼鱼24 h死亡率的影响Figure 2 Effects of different concentrations of Scutellaria barbara on the 24-hour lethallty rate of zebra fish larvae

2.2 SB对高糖诱导斑马鱼GLU值的影响

综合斑马鱼幼鱼对不同浓度SB耐受性的特点，选取200 μg/mL、400 μg/mL 和 800 μg/mL SB用于开展SB靶向降糖作用功效评价。研究结果发现，以10 mg/mL GLU处理可明显增加斑马鱼幼鱼组织中的GLU值，达到12.97%（p＞ 0.05）。另外，与 10 mg/mL GLU 处理组相比，200 μg/mL、400 μg/mL 和 800 μg/mL SB 处理可以降低斑马鱼葡萄糖值分别达到28.32%（p＞0.05）、27.11%（p＜ 0.05）和 35.37%（p＜ 0.05），表明适宜剂量浓度的SB具有降糖作用（图3）。

图3 黄芩对高糖诱导斑马鱼葡萄糖值的影响Figure 3 Effects of Scutellaria barbara on the values of glucose of hyperglycemia-induced zebra fish larvae

2.3 SB对糖尿病斑马鱼GLU值的影响

从图3可看出，与空白对照组相比，10 mg/mL GLU单独诱导组并未显著增加GLU值（p＞0.05），但 10 mg/mL GLU 和 0.025 mM ALX 联合处理组GLU值从0.0930 mM增加到0.2129 mM，增长1.29倍（p＜ 0.05）。相比糖尿病模型对照组，200 μg/mL、400 μg/mL 和 800 μg/mL SB处理组斑马鱼GLU值分别降低了7.37%、8.36%和8.31%，差异均不显著（p＞ 0.05），但是ACA处理组GLU值降低了17.90%（p＜ 0.05）。结果表明SB具有一定的降糖能力，但其降糖效应明显低于ACA。

图4 黄芩对糖尿病斑马鱼葡萄糖值的影响Figure 4 Effects of Scutellaria barbara on the values of glucose of diabetic zebra fish larvae

4 讨论与结论

SB属多年生草本植物，其作为一种中药始载于《神农本草经》，是治疗感冒、流感、发烧等的常用药物。传统中医认为SB具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。现代研究发现，SB中富含黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素和汉黄芩苷等多种功能活性成分[9]。Li等[10]研究发现SB中富含的芩黄素（apigenin）、黄芩黄素（baicalein）、黄芩素（scutellarin）、5,7-二羟黄酮（chrysin）、芹菜素（apigenin-7-O-glucuronide）和黄芩苷（baicalin）等8种黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有较强的抑制能力，且抑制作用强于阿卡波糖。Wang等[11]基于通路蛋白和蛋白互作关联网络（a pathway-based protein-protein association network）分析发现 5,7-二羟黄酮（chrysin）、汉黄芩素（wogonin）和5,8,20-trihydroxy-7-methoxy flavone是 α-葡萄糖苷酶抑制剂的主要活性成分，而5-羟色胺能突触通路（the serotonergic synapse pathway）是黄芩苷抗2型糖尿病的关键通路。本试验以斑马鱼为对象，研究发现不同浓度（200 μg/mL、400 μg/mL和800 μg/mL）SB提取物对高糖诱导模型中和胰岛损伤模型中斑马鱼GLU值均有降低作用，与刘智等[12]研究结果一致，他们研究发现 SB 茎叶总黄酮（75 mg/kg/d 和 150 mg/kg/d）可以显著降低2型糖尿病型高脂血症大鼠血糖。另赵碧玲等[13]也研究发现黄芩苷（160 mg/kg/d）可以显著降低糖尿病肾病SD雄性大鼠的血糖，表明SB具有一定的降糖效应。

SB降糖作用机制可能与增强机体抗氧化[14-15]、改善胰岛素敏感性[13]、促进血脂稳定[16]与改善肠道微生态[17]等有关。Park等[14]研究发现SB甲醇提取物中约含有91.8 mg/g没食子酸当量的多酚物质，对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，并且清除DPPH自由基能力较强，可显著降低过氧化氢诱导的人白细胞DNA损伤。陈丽等[15]研究发现SB（10 g/kg/d，每mL SB提取物含生药2 g）显著提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性，显著降低丙二醛含量，表明SB可以显著增加机体的抗氧化能力，减轻组织自由基代谢紊乱。刘智等[12]研究发现SB茎叶总黄酮（75 mg/kg/d和 150 mg/kg/d）可以显著提升胰岛素敏感性指数，表明SB茎叶总黄酮降糖降脂与改善胰岛素抵抗作用有关。王胜男等[16]研究发现，SB提取物（210 mg/kg/d、420 mg/kg/d和840 mg/kg/d）可以显著降低糖尿病小鼠血清甘油三酯水平。Na等[17]研究发现SB可改善2型糖尿病患者糖耐量，并可改善肠道菌群平衡，尤其显著增加乳酸杆菌（Lactobacillus）和阿克曼菌（Akkermansia）丰度，并改善炎症反应。可见SB可能成为治疗糖尿病的潜在药物，但也有不一致的结果。胡蜀红等[18]研究发现黄芩苷（200 mg/kg/d）可降低糖尿病大鼠糖化血红蛋白含量和肾小球血管内皮生长因子的表达量，但对血糖无明显影响。本试验以斑马鱼为生物模型，系统研究了不同SB浓度和不同孵育时间下对斑马鱼幼鱼生物耐受性的影响，并开展了高糖诱导型（过食）和胰岛素损伤型（糖尿病）斑马鱼靶向降糖作用评价。随着科学技术的进步与发展，需要构建稳定可靠的生物模型，继续深入开展SB靶向降糖作用及其干预机制等研究，开展SB叶的生物活性、科学及安全性评价；继续瞄准亚健康人群开展靶点研究和功效评价，开发精准营养与个性化功能性饮品等。

本试验结果表明，斑马鱼（5 dpf）对高浓度的SB具有不耐受性，孵育48 h 时的LC50为4 621.832 μg/mL，95% 可信范围为 4 031.335 ～5 376.152 μg/mL。按10% ～ 25% LC50剂量浓度推荐可用于靶向功效评价的适宜剂量浓度为462.18 ～1 155.46 μg/mL。在 10 mg/mL GLU 诱导斑马鱼模 型 中，200 μg/mL、400 μg/mL 和 800 μg/mL SB处理斑马鱼GLU值分别降低了28.32%（p＞0.05）、27.11%（p＜ 0.05）和 35.37%（p＜ 0.05）；在 10 mg/mL GLU 和 0.025 mM ALX 诱导的糖尿病斑马鱼模型中，200 μg/mL、400 μg/mL 和800 μg/mL SB处理组斑马鱼GLU值分别降低了7.37%、8.36%和8.31%，但差异均不显著（p＞0.05）。表明SB对过饮过食、糖尿病前驱或糖尿病患者具有一定的降糖作用，作为我国传统中药材其在功能食品上具有广阔的应用前景，SB叶可开发为保健茶饮。